李玉蕾，顏 慧，蘇瑞斌

（軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京100850）

原代培養(yǎng)的神經(jīng)元因具有能較真實地反映在體神經(jīng)元特點、實驗條件相對恒定、影響因素單一、便于直接觀察和各項指標檢測等優(yōu)點，成為神經(jīng)科學研究領域廣泛應用的一種細胞模型[1-3]。在單個神經(jīng)元生長發(fā)育和形態(tài)結構研究，突觸形成與功能研究，神經(jīng)元相關蛋白的亞細胞定位和轉運以及電生理研究等方面，需要神經(jīng)元在低密度培養(yǎng)條件下保持良好的生長狀態(tài)。但神經(jīng)元作為高度分化的細胞，其生長過程對細胞密度的依賴性較強，常規(guī)的神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法無法使其在低密度培養(yǎng)條件下存活。本研究利用免疫磁珠（immunomagnetic bead，IMB）細胞分選技術結合星形膠質細胞條件培養(yǎng)基（astrocyte conditioned medium，A-CM）進行低密度條件下的神經(jīng)元原代培養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B-27添加劑、含Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖液（Dulbecco’s phosphate buffered saline，DPBS）和磷酸鹽緩沖液（PBS），美國Thermo Fisher Scientific 公司；青、鏈霉素混合液（100×），北京索萊寶科技有限公司；多聚賴氨酸（poly-L-lysine hydrobromide，PLL）和胰酶，美國Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），北京經(jīng)科宏達生物技術有限公司；小鼠神經(jīng)元分離試劑盒、MS柱、磁激活細胞分選儀（magnetic activated cell sorter，MACS），德國Miltenyi Biotec公司；4%多聚甲醛固定液，北京Labgic 技術有限公司；吐溫20，國藥集團化學試劑有限公司；Triton X-100，北京希凱創(chuàng)新科技有限公司；小鼠160 ku神經(jīng)絲單克隆抗體、雞抗膠質原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體，美國Abcam 公司；Alexa Fluor 488 標記山羊抗小鼠IgG熒光二抗，美國Life Technologies 公司；DyLight 405 標記山羊抗雞IgG 熒光二抗，美國Jackson Immuno公司；Hoechst33342，美國MP公司；XTD-4體式顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；EVOSf1熒光倒置顯微鏡，美國AMG公司。

1.2 實驗動物

SPF 級新生24 h 內(nèi)昆明小鼠，雌雄不限，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（京）2016-002。

1.3 星形膠質細胞條件培養(yǎng)基的制備

參照張蕓等[4]的方法進行星形膠質細胞原代培養(yǎng)。新生24 h 內(nèi)昆明小鼠，75%乙醇浸泡消毒，斷頭，沿縱軸撕開皮膚和顱骨，打開顱腔，取出腦組織，體式顯微鏡下撕去腦膜，取大腦半球，剪碎。加適量胰酶1.5 g·L-1，37℃消化15 min（每5 min震搖1 次），加入等體積含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，玻璃吸管吹打數(shù)次至無明顯組織塊。細胞懸液經(jīng)70 μm細胞篩過濾，100×g離心10 min后棄上清。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基吹散細胞沉淀，接種于經(jīng)PLL預處理的培養(yǎng)瓶，置細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 d（每2 d換液1次）后，置37℃搖床15×g振蕩18 h，棄培養(yǎng)基。細胞經(jīng)新鮮培養(yǎng)基洗1 遍，加胰酶1.5 g·L-1消化，傳代至75 cm2培養(yǎng)瓶與35 mm細胞培養(yǎng)皿中，并將剩余細胞凍存。經(jīng)細胞免疫熒光染色鑒定星形膠質細胞的純度達到要求后，更換含B-27 添加劑的Neurobasal培養(yǎng)基，24 h后更換培養(yǎng)基，原培養(yǎng)基經(jīng)70 μm細胞篩過濾后即為A-CM。

1.4 免疫熒光法鑒定星形膠質細胞

35 mm細胞培養(yǎng)皿中的細胞棄培養(yǎng)基，PBS浸洗2 次（每次5 min），4%多聚甲醛固定液固定20 min。PBS 浸洗2 次，加含0.2%Triton X-100 的PBS 打孔5 min。PBS 浸洗1 次，加入含10%BSA的PBS 封閉20 min。PBS 浸洗1 次，加一抗（雞抗GFAP多克隆抗體，1∶100）4℃孵育過夜。含2%吐溫20 的PBS 浸洗3 次，加含0.2% Triton X-100 和2.5%BSA 的PBS 打孔5 min；而后加熒光二抗（DyLight 405 標記山羊抗雞IgG 熒光二抗，1∶100）室溫孵育1 h。加含2%吐溫20 的PBS 浸洗3 次后，以Hoechst33342 1 μmol·L-1染核5 min，再以含2%吐溫20 的PBS 浸洗2 次。用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.5 免疫磁珠法分選神經(jīng)元

按1.3 取新生24 h 內(nèi)昆明小鼠大腦，分離海馬和皮質，置于不同小燒杯中剪碎，經(jīng)胰酶消化制成細胞懸液后過篩混勻，而后用臺盼藍染色進行活細胞計數(shù)。將細胞懸液以200×g離心5 min，完全吸出上清液。每1×107細胞加含0.5% BSA 的DPBS 緩沖液（簡稱緩沖液）80 μL和非神經(jīng)元細胞生物素抗體混合液20 μL，輕柔混勻（不要渦旋），2～8℃孵育5 min。每1×107細胞加緩沖液1 mL 洗滌細胞，4℃、200×g離心5 min，完全吸出上清液。每1×107細胞加緩沖液80 μL和抗生物素微珠20 μL，輕柔混勻（不要渦旋），2～8℃孵育10 min。加緩沖液，調(diào)節(jié)細胞懸液總體積至500 μL（總細胞數(shù)≤1×107）。將MS 柱置MACS 分離器的磁場中，加500 μL 緩沖液潤洗MS柱。加細胞懸液，收集含有未標記細胞（即神經(jīng)元細胞）的流出液。用500 μL緩沖液洗滌柱子3次，繼續(xù)收集未標記的神經(jīng)元細胞，與上一步中的流出液合并，經(jīng)200×g 離心5 min，棄上清，細胞沉淀加入適量A-CM 重懸后用臺盼藍染色計數(shù)，按每cm2接種（0.5～1）×104細胞的密度接種至經(jīng)PLL預處理的24孔板或35 mm培養(yǎng)皿。每48 h半量換液。

1.6 免疫熒光法鑒定神經(jīng)元

培養(yǎng)6 d 的神經(jīng)元棄培養(yǎng)基，PBS 浸洗2 次，4%多聚甲醛固定液固定20 min。PBS 浸洗2 次，加含0.2%Triton X-100的PBS打孔5 min。PBS浸洗1次，含10%BSA的PBS封閉20 min。PBS浸洗1次，加一抗（小鼠抗160 ku 神經(jīng)絲單克隆抗體，1∶100）4℃孵育過夜。加含2%吐溫20 的PBS 浸洗3次，含0.2%Triton X-100和2.5%BSA的PBS打孔5 min；加熒光二抗（Alexa Fluor 488 標記山羊抗小鼠IgG熒光二抗，1∶100）室溫孵育1 h。含2%吐溫20的PBS浸洗3次，熒光倒置顯微鏡觀察、拍照。

2 結果

2.1 制備A-CM所需小鼠星形膠質細胞純度鑒定

采用抗星形膠質細胞特異性標志物GFAP 抗體進行細胞免疫熒光染色（紅色），Hoechst33342標記細胞核（藍色）進行細胞純度鑒定（圖1）。星形膠質細胞的純度＞95%，達到了制備A-CM 的細胞純度要求。

Fig.1 lmmunofluorescence staining of cultured astrocytes with glial fibrillary acidic protein（GFAP）markers.

2.2 lMB細胞分選后小鼠皮質及海馬神經(jīng)元形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下觀察（圖2），剛接種的皮質或海馬神經(jīng)元細胞呈懸浮狀態(tài)，胞體球形，小而透亮。1 d后絕大多數(shù)神經(jīng)元貼壁伸展，產(chǎn)生1～3個短突起，長度10～50 μm。2 d后神經(jīng)元突起增多，產(chǎn)生二級分支。部分神經(jīng)元軸突與樹突區(qū)分明顯，突起末端膨大形成生長錐并有許多絲狀偽足伸出，表明突起處于生長階段。個別神經(jīng)元軸突長度＞200 μm。3 d后神經(jīng)元突起持續(xù)增多，產(chǎn)生三、四級分支。部分無軸突神經(jīng)元發(fā)出多個樹突形成網(wǎng)狀結構，直徑為胞體的6～10 倍。5 d 后多數(shù)有軸突神經(jīng)元軸突和樹突生長錐明顯，無軸突神經(jīng)元樹突的網(wǎng)狀結構變得更加密集，表明神經(jīng)元發(fā)育成熟。

Fig.2 Morphology of cultured cerebral cortical and hippocampal neurons at different stages during culture-days in vitro（DlV）1，2，3 and 5.

2.3 lMB細胞分選后小鼠皮質和海馬神經(jīng)元鑒定

采用抗神經(jīng)元特異性標志物160 ku 神經(jīng)絲抗體對培養(yǎng)6 d 的神經(jīng)元進行細胞免疫熒光染色（綠色）（圖3）。結果顯示，在較低密度下，神經(jīng)元發(fā)育良好，突起多而明顯，純度較高。

Fig.3 lmmunofluorescence staining of DlV 6 cultured cerebral cortical and hippocampal neurons with 160 ku neurofilament medium markers.

3 討論

與體內(nèi)或體外高密度培養(yǎng)神經(jīng)元網(wǎng)絡功能分析的復雜性相比，單細胞和小群體分析提高了實驗因果關系的精準度。因此，低密度培養(yǎng)條件下的神經(jīng)元在神經(jīng)科學研究領域如神經(jīng)元亞細胞結構變化和離子通道型受體功能等方面發(fā)揮著至關重要的作用。然而，維持神經(jīng)元正常狀態(tài)依賴于周邊神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的旁分泌營養(yǎng)支持。細胞密度越低，旁分泌支持越少，培養(yǎng)越困難。

目前，神經(jīng)元的低密度培養(yǎng)主要有3 種方法：①使用含特殊配方的培養(yǎng)基維持神經(jīng)元的存活，同時抑制神經(jīng)膠質細胞增殖[5]；但該法培養(yǎng)的神經(jīng)元的表型分化特征不夠完全。②在膠質細胞層上方直接接種神經(jīng)元[6]或在膠質細胞增殖條件下培養(yǎng)神經(jīng)元，膠質細胞可在神經(jīng)元下方迅速形成單細胞層[7]；該法因神經(jīng)元和膠質細胞混合培養(yǎng)，不適合活細胞成像或免疫熒光染色。③利用共培養(yǎng)技術，將神經(jīng)元接種在預先涂有石蠟點作為支撐的蓋玻片上，再將其置生長有星形膠質細胞的培養(yǎng)皿中，星形膠質細胞提供神經(jīng)元生長所需要的營養(yǎng)支持[8]；但該法的前期準備工作量較大，操作復雜。

本研究只需預先準備高純度星形膠質細胞培養(yǎng)物，利用其正常生長過程中分泌的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子制備A-CM，為低密度條件下的神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持。在神經(jīng)元培養(yǎng)過程中定期半量更換A-CM而無需其他過多的操作即可維持神經(jīng)元的正常生理狀態(tài)，且多出的星形膠質細胞可凍存?zhèn)溆谩?/p>

在對培養(yǎng)神經(jīng)元純化過程中，多數(shù)研究人員通過在取材過程中剝除腦膜去除成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞污染，加阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元細胞的增殖，從而提高神經(jīng)元的純度[9-10]。阿糖胞苷的作用機制是通過抑制細胞周期S期的DNA合成，從而干擾細胞的增殖。但這一特性也會對神經(jīng)元產(chǎn)生細胞毒性，影響神經(jīng)元的存活、形態(tài)和功能[11]，尤其是在低密度培養(yǎng)條件下。本研究利用IMB 細胞分選技術無需腦膜剝除操作步驟，極大縮短了操作時間及其對神經(jīng)元存活率的影響；也無需添加阿糖胞苷，縮短了培養(yǎng)周期，提高了實驗效率。

IMB技術建立于20世紀80年代。Guesdon和Avrameas[12]在1977 年首先描述了通過丙烯酰胺和瓊脂糖的聚合制備的親水性磁珠的制備方法。1982年，Rembaum等[13]將其應用于細胞分選。目前，細胞分選是IMB應用最主要的一個方面。其基本原理是經(jīng)過一定處理的IMB 與抗體結合成為抗體載體，再與特異性抗原結合形成抗原-抗體-磁珠免疫復合物，在磁場中通過分選柱時會滯留其中，從而達到分離特異性抗原的目的。包括磁性標記目的細胞的陽性分選和磁性標記非目的細胞的陰性分選。本研究使用的神經(jīng)元分離試劑盒屬于陰性分選，具體來說，是將非神經(jīng)元細胞如星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等利用特異的生物素結合的單克隆抗體進行標記后，再被IMB結合的抗生物素單克隆抗體標記。這些細胞在通過磁場時被截留在MS 柱中，而未標記的神經(jīng)元細胞得以通過。該法與流式細胞分選技術相比操作過程簡單迅速，可實現(xiàn)全程無菌利于細胞的繼續(xù)培養(yǎng)，細胞活性也不會受到明顯影響。

本研究利用IMB細胞分選技術結合A-CM進行低密度條件下神經(jīng)元原代培養(yǎng)，通過對神經(jīng)元形態(tài)學觀察與細胞免疫熒光染色鑒定，培養(yǎng)的神經(jīng)元顯示出正常的生長發(fā)育過程和形態(tài)結構特點，證明該實驗方法簡單有效，可重復性高，為神經(jīng)科學基礎研究、相關疾病的機制探討及藥物篩選提供了較理想的實驗模型。