(武漢市三醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢430074)

隨著手術(shù)、放療、化療等綜合治療方法的發(fā)展和改進(jìn)，早期宮頸癌的療效取得了很大的進(jìn)展，但中晚期宮頸癌的療效仍然不能令人滿意[1]。中晚期宮頸癌的高度增殖活性和侵襲性直接導(dǎo)致了預(yù)后不良，因此，積極研究宮頸癌發(fā)生增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并尋求相應(yīng)的治療靶點，對于提高宮頸癌的整體療效有十分明顯的臨床意義[1]。以往針對宮頸癌的靶向治療主要集中在蛋白靶點，但近年來，一種新型的非編碼RNA逐漸引起了腫瘤學(xué)者的重視。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一大類長度超過200個核苷酸的特殊RNA，由于不具備蛋白質(zhì)編碼能力長期未受到腫瘤研究者的重視。但近年來越來越多的研究表明，lncRNA在多種腫瘤中具有關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用[2-3]，跟蛋白靶點一樣，lncRNA同樣可以作為癌基因存在[4]。然而，關(guān)于lncRNA和宮頸癌之間的關(guān)系，以及l(fā)ncRNA如何促進(jìn)宮頸癌的增殖和侵襲活性，這方面的研究尚處于早期階段。本研究首先通過檢測一種新型lncRNA細(xì)胞骨架RNA(cytoskeleton regulator RNA, CYTOR)在宮頸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)，然后進(jìn)一步探討CYTOR通過調(diào)控miR-125b-5p和HK2對宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和有氧糖酵解的影響，為尋求宮頸癌新的治療靶點提供實驗依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 組織、細(xì)胞株、試劑及儀器

選取來源于本院2014年5月至2018年5月的宮頸癌組織及癌旁組織30例，納入標(biāo)準(zhǔn)：符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)分類標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)病理確診為宮頸癌，宮頸癌分期采用FIGO分期。4種人宮頸癌細(xì)胞株(Hela、C33A、Caski和SiHa)和人宮頸上皮細(xì)胞(H8)購于中科院上海細(xì)胞研究所。Si-CYTOR(sh1:CTGGAAACCTCTTGACTCT；sh2:CAGGAAGCTCTATGACACA)和pcDNA-HK2過表達(dá)載體(HK2全長序列見https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M23115.1)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司；RNA提取試劑盒Trizol購于Invitrogen公司；實時定量SYBR Green和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TAKATA公司，引物由上海生工生物合成；HK2抗體和內(nèi)參抗體購于Abcam公司；增殖檢測CCK8試劑盒購于碧云天公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒購于Promega公司；Western blot用電泳儀和轉(zhuǎn)印儀購于Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人宮頸癌細(xì)胞株(Hela、C33A、Caski和SiHa)和人宮頸上皮細(xì)胞(H8)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中含10%胎牛血清和青鏈霉素雙抗)，培養(yǎng)條件：溫度37 ℃、含5%CO2。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，用胰酶消化后選取2 mL細(xì)胞懸液并接種到6孔板中(保持細(xì)胞密度為1×105個/mL)，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后按照Lipofectamine 2000說明書方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染物包括si-CYTOR、miR-125b-5p inhibitor和pcDNA-HK2，轉(zhuǎn)染48 h后用于下一步檢測實驗。

1.3 熒光定量PCR檢測CYTOR、miR-125b-5p和HK2的表達(dá)

收集宮頸癌組織及轉(zhuǎn)染后48 h的宮頸癌細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取宮頸癌組織和細(xì)胞總RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA。熒光定量PCR檢測方法以U6和GAPDH作為內(nèi)參照，引物序列如下：U6 F為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R為5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH F為5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA3-3′，R為5′-GCGCCCAAT ACGACCAAATC′-3′；CYTOR F(2143-2162)為5′-AGAATGAAGGCTGAGGTGTG-3′，R為(2465-2484)5′-CAGCGACCATCCAGTCATTTA-3′；miR-125b-5p F為5′-TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA-3′，R為5′-AG TCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；HK2 F為5′-CAAA GTGACAGTGGGTGTGG-3′，R為5′-GCCAGGTCCTTCACTGTCTC-3′。按熒光定量試劑盒說明建立PCR反應(yīng)體系(包括2 μL cDNA、10 μL SYBR Green Mix、上下游引物。PCR運(yùn)行參數(shù)中設(shè)置：95 ℃ 3 min，然后進(jìn)行下列反應(yīng)：92 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，一共進(jìn)行35個循環(huán)。PCR檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行匯總分析。

1.4 宮頸癌細(xì)胞的增殖活性的檢測(CCK-8法)

培養(yǎng)HeLa細(xì)胞使之處于對數(shù)生長期，然后接種細(xì)胞于96孔板中(保持細(xì)胞密度為2×104個/孔)，細(xì)胞中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)立3個平行對照。在HeLa細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染si-CYTOR、pcDNA-HK2和miR-125b-5p inhibitor。檢測前加入10 μL CCK-8溶液，然后將細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后測定450 nm處的光密度OD值。所有操作依照CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 Transwell法檢測宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力

將HeLa細(xì)胞用胰酶消化后接種于Transwell小室內(nèi)，Transwell上室加100 μL HeLa細(xì)胞懸液，下室加250 μL培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，在37 ℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出小室后用PBS溶液沖洗2遍，然后用4%多聚甲醛固定15 min，最后用結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，Transwell板干燥后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況。

1.6 Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡

選取HeLa細(xì)胞并培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用PBS清洗后均勻地混合HeLa細(xì)胞與500 μL預(yù)冷的結(jié)合緩沖液和5 μL Annexin-V-FITC，避光放置15 min，上機(jī)前5 min加入2.5 μL PI溶液進(jìn)行染色，均勻混合后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。所有操作依照Annexin V-FITC/PI試劑說明書進(jìn)行。

1.7 雙熒光素酶報告基因驗證miR-125b-5p和CYTOR/HK2之間的互作關(guān)系

首先將CYTOR 3′UTR靶序列或HK2 3′UTR靶序列插入到熒光素酶載體下游。并設(shè)置突變載體作為對照進(jìn)行熒光素酶驗證實驗，具體操作如下：每孔細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pmir-GLO-CYTOR-3′UTR 200 ng、pmir-GLO-HK2-3′UTRmiRNA、mimic 500 ng及陰性對載體200 ng。用Opti-MEM培養(yǎng)基將Lipofectamine2000稀釋后，室溫下放置5 min；然后混合轉(zhuǎn)染試劑和載體DNA和mimic，室溫下放置20 min后，用Opti-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行充分混勻；然后在溫度37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。整個檢測步驟依照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書，并以載體本身的熒光值作為內(nèi)對照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CYTOR在宮頸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)升高

首先，利用熒光定量PCR探明CYTOR在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，相比癌旁組織(圖1A)，CYTOR在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯增高(3.29±2.21vs8.39±4.86,t=6.83，P<0.01)；對30例宮頸癌患者的CYTOR和臨床病理特性進(jìn)行了分析，結(jié)果見表1所示，分期是導(dǎo)致CYTOR表達(dá)差異的重要因素。熒光定量PCR結(jié)果表明，相比I/II級宮頸癌組織(圖1B)，CYTOR在III/IV宮頸癌中的表達(dá)也明顯升高(5.25±2.02vs9.77±5.12，t=3.99，P<0.01)。同時細(xì)胞實驗表明，相比人正常宮頸上皮細(xì)胞H8，CYTOR在宮頸癌細(xì)胞系(Hela、C33A、Caski和SiHa)中的表達(dá)水平明顯增高(t=19.71、16.23、-19.38、20.39，P<0.01，圖1C)。以上結(jié)果顯示，CYTOR的異常表達(dá)升高可能與宮頸癌的惡性生物學(xué)行為存在密切關(guān)聯(lián)。

表1 30例宮頸癌患者臨床病例特征與CYTOR表達(dá)的關(guān)系

圖1 CYTOR在宮頸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)A：CYTOR在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(dá);B：CYTOR在I/II級宮頸癌以及III/IV宮頸癌中的表達(dá);C：CYTOR在宮頸癌細(xì)胞以及正常上皮細(xì)胞中的表達(dá) 與Adjacent比較，△P<0.05;與Ⅰ/Ⅱ比較，#P<0.05;與H8組比較，*P<0.05

2.2 抑制CYTOR對宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

熒光定量PCR法檢測結(jié)果(圖2A)顯示，相比于對照組，轉(zhuǎn)染CYT OR siRNA可明顯下調(diào)CYTOR在宮頸癌細(xì)胞HeLa中的表達(dá)(P<0.05)，且轉(zhuǎn)染si-CYTOR#1的效果優(yōu)于si-CYTOR#2和si-CYTOR#3，在接下來的實驗中選用si-CYTOR#1。CCK-8檢測結(jié)果顯示(圖2B)，抑制CYTOR可抑制HeLa細(xì)胞的增殖活力(t=7.23，P<0.01)。Transwell檢測結(jié)果顯示(圖2C)，抑制CYTOR可抑制HeLa細(xì)胞的侵襲能力(t=8.85，P<0.01)。此外，細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示(圖2D)，抑制CYTOR可促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡(t=12.78，P<0.01)。以上實驗結(jié)果顯示，抑制CYTOR可抑制HeLa細(xì)胞的增殖和侵襲能力并促進(jìn)其凋亡。

圖2 抑制CYTOR后對宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的影響A：CYTOR表達(dá)量的變化；B：對宮頸癌細(xì)胞增殖；C：對宮頸癌細(xì)胞侵襲；D：宮頸癌細(xì)胞凋亡與si-NC組比較，*P<0.05

2.3 抑制CYTOR對宮頸癌細(xì)胞有氧糖酵解代謝的影響

腫瘤的有氧糖酵解能力增強(qiáng)是腫瘤獲得快速增殖和侵襲的重要機(jī)制，為了探明CYTOR對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能影響的具體機(jī)制，對有氧糖酵解活性進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，抑制CYTOR后，無論是對葡糖糖的攝取水平(圖3A)，還是乳酸(圖3B)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)(圖3C)的生成水平均發(fā)生了明顯下降(t分別為6.86,7.52,6.95，P<0.01)，表明CYTOR對維持宮頸癌細(xì)胞的有氧糖酵解水平有重要作用。

2.4 CYTOR靶向調(diào)控miR-125b-5p在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)

利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Stabase V3.0數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測miR-125b-5p可能是CYTOR的靶基因，其預(yù)測序列如圖4A所示。雙熒光素酶報告基因驗證結(jié)果(圖4B)顯示，過表達(dá)miR-125b-5p可使熒光素酶活性顯著下降(t=6.58，P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染miR-125b-5p mimics和靶向位點發(fā)生突變的pmirGLO-CYTOR-mut載體，miR-125b-5p對熒光素酶活性未發(fā)生明顯作用。采用熒光定量PCR檢測CYTOR抑制后miR-125b-5p在Hela中表達(dá)水平，結(jié)果(圖4C)顯示，CYTOR抑制后顯著促進(jìn)miR-125b-5p的表達(dá)(t=16.52，P<0.01)。通過對30例宮頸癌標(biāo)本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，CYTOR與miR-125b-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r2=0.377，P<0.01，圖3D)。由此可知，miR-125b-5p與CYTOR存在直接作用，CYTOR可負(fù)調(diào)控miR-125b-5p的表達(dá)。

2.5 miR-125b-5p靶向調(diào)控HK2在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)

通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Stabase V3.0對miR-125b-5p的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)HK2是miR-125b-5p的候選靶基因，隨后采用熒光素酶報告基因驗證，miR-125b-5p可以結(jié)合HK2的3′UTR靶序列(圖5A)，并且miR-125b-5p可以抑制HK2的表達(dá)(t=7.32，P<0.05，圖5B)。采用熒光定量PCR檢測miR-125b-5p抑制后對HK2 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，miR-125b-5p抑制后可顯著促進(jìn)HK2 mRNA在Hela細(xì)胞中的表達(dá)(t=18.35，P<0.01，圖5C)。同樣對30例宮頸癌組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示miR-125b-5p與HK2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r2=0.265，P<0.01，圖5D)。上述結(jié)果表明，HK2是miR-125b-5p的靶基因，同時miR-125b-5p可負(fù)調(diào)控HK2的表達(dá)。

圖3 抑制CYTOR后對宮頸癌細(xì)胞有氧糖酵解能力的影響A：宮頸癌細(xì)胞葡糖糖攝??；B：宮頸癌細(xì)胞乳酸生成；C：宮頸癌細(xì)胞ATP生成與si-NC組比較，*P<0.05

3 討 論

通常認(rèn)為，包括宮頸癌在內(nèi)的惡性腫瘤的發(fā)生，內(nèi)在癌基因的促進(jìn)起到了十分關(guān)鍵的作用。因此，在過去幾十年，對癌基因及以其為靶點的研究成為熱門，傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為，癌基因就是蛋白質(zhì)，因此惡性腫瘤的發(fā)生與蛋白質(zhì)靶點的突變和異常相關(guān)，這使得研究者的焦點主要集中在基因編碼即編碼RNA領(lǐng)域，而忽視了占轉(zhuǎn)錄本上絕大部分的非編碼RNA，使得非編碼RNA產(chǎn)物在以往通常被稱之為“轉(zhuǎn)錄暗物質(zhì)”。但近年來，隨著對基因表達(dá)調(diào)控尤其是表觀遺傳學(xué)的深入研究，非編碼RNA也是影響惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素甚至是決定性因素。目前，非編碼RNA主要分為小分子RNA(microRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA，tRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)等幾大類別，其中尤以LncRNA受到特別的關(guān)注。LncRNA是一大類長度超過200 bp的轉(zhuǎn)錄本，作為一種近年來新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，被認(rèn)為在調(diào)控惡性腫瘤的生物學(xué)行為中起到了關(guān)鍵作用，例如LncRNA參與了惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、抗凋亡、耐藥等諸多惡性表型[4]。例如在宮頸癌中，lncRNA HOXD簇反義RNA 1(HOXD cluster antisense RNA 1,HOXD-AS1)可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖[5]；同樣的，結(jié)直腸腫瘤差異表達(dá)基因(Colorectal Neoplasia Differentially Expressed,CRNDE)也被認(rèn)為是一個促進(jìn)宮頸癌增殖和侵襲活性的癌基因[6]。CYTOR是一個近年來新發(fā)現(xiàn)的一個lncRNA，被認(rèn)為在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用，例如在非小細(xì)胞肺癌中，CYTOR可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲并促進(jìn)對放射治療的抗拒性[7]。又比如在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，CYTOR可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，被認(rèn)為是一個癌基因[8]。但目前為止，CYTOR在宮頸癌中的作用及機(jī)制如何，尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，CYTOR在宮頸癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，揭示了CYTOR在促進(jìn)宮頸癌惡性表型中的作用。同時功能實驗證實，抑制CYTOR的表達(dá)可以明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲活性，同時宮頸癌細(xì)胞的有氧糖酵解能力也顯著下降。這些實驗表明，CYTOR很可能是通過調(diào)節(jié)有氧糖酵解能力來調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲活性的。

圖5 miR-125b-5p靶向調(diào)控HK2的表達(dá)A：HK2 mRNA 3UTR與miR-125b-5p存在互補(bǔ)關(guān)系；B：熒光素酶實驗證實HK2 mRNA與miR-125b-5p存在相互作用；C：抑制miR-125b-5p對HK2表達(dá)的影響；D：直線相關(guān)分析證實HK2與miR-125b-5p存在線性表達(dá)關(guān)系與miR-NC組比較，*P<0.05,與si-NC比較，#P<0.05

LncRNA可以通過多種途徑調(diào)控基因功能，例如與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，也可直接與信使RNA(messenger RNA,mRNA)結(jié)合調(diào)控靶基因的穩(wěn)定性，但目前研究LncRNA的焦點還是集中在“分子海綿”這一獨特作用上。LncRNA可以特異性地與相應(yīng)microRNA相結(jié)合，從而發(fā)揮“分子海綿”的作用影響microRNA對靶基因的調(diào)控[9]。例如UCA1通過吸附miR-206從而促進(jìn)宮頸癌的轉(zhuǎn)移活性[10]。在本研究中，通過生物信息學(xué)和熒光素酶互作實驗證實，CYTOR可以競爭性吸附miR-125b-5p來促進(jìn)癌基因HK2轉(zhuǎn)錄。miR-125b-5p被認(rèn)為是一個抑癌基因，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。例如，miR-125b-5p可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[11]；同樣的，在喉癌細(xì)胞中，miR-125b-5p可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其高表達(dá)可以提示喉癌患者具有良好的預(yù)后[12]。本研究也首次證實了miR-125b-5p在宮頸癌細(xì)胞中同樣發(fā)揮抑癌基因的作用，抑制CYTOR導(dǎo)致的miR-125b-5p活性提高可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。因此，宮頸癌細(xì)胞中CYTOR的高表達(dá)，可能通過競爭性下調(diào)miR-125b-5p的活性，從而發(fā)揮癌基因的作用。

維持能量供給是細(xì)胞存活的先決條件之一，不同于正常細(xì)胞主要通過線粒體氧化途徑來供能，包括宮頸癌細(xì)胞在內(nèi)的多種癌細(xì)胞，即使在氧氣充足的條件下，依然優(yōu)先通過有氧糖酵解途徑來供能，這種特殊的有氧糖酵解活性，被認(rèn)為是惡性腫瘤的十大重要特征之一[13]。因此，靶向有氧糖酵解通路，或者靶向調(diào)控有氧糖酵解的關(guān)鍵酶，被認(rèn)為是抗腫瘤研究的熱門方向。HK2作為影響糖酵解途徑的關(guān)鍵限速酶之一，參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是一個潛在的腫瘤治療靶點[14]。本研究通過熒光素酶實驗證實，HK2可以與CYTOR/miR-125b-5p軸發(fā)生直接相互作用，CYTOR可能促進(jìn)HK2的表達(dá)來促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲活性，同時也增加了宮頸癌細(xì)胞的有氧糖酵解能力。同時表明，CYTOR/miR-125b-5p/HK2這一全新分子軸在宮頸癌的增殖侵襲以及有氧糖酵解調(diào)控上發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究通過功能實驗證實，lncRNA CYTOR通過下調(diào)miR-125b-5p來上調(diào)HK2表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和有氧糖酵解活性，從而促進(jìn)宮頸癌的惡性表型。研究結(jié)果揭示CYTOR/miR-125b-5p/HK2有可能成為宮頸癌治療的有效靶點。但更具體的分子機(jī)制和靶向?qū)m頸癌治療效果，有待今后進(jìn)一步更細(xì)致深入的分子通路和動物實驗來證實。