綦宇軒，徐 媛，符志楊，關(guān)麗萍

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

異喹啉類生物堿(Isoquinolines）是自然界中植物體內(nèi)所分布數(shù)量多、結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜的一類生物堿。四氫異喹啉類生物堿作為天然的先導(dǎo)化合物，在植物中分布比較廣泛，將其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾、改造和優(yōu)化是豐富四氫異喹啉生物堿結(jié)構(gòu)多樣性的重要途徑。研究表明四氫異喹啉類生物堿及其衍生物具有多種藥理活性，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗腫瘤抗癌、抗炎癥和抗病原微生物等[1-3]。

OSHIRO，et al[4]在篩選具抗抑郁活性的3，4-二氫-2(1H)-喹啉酮類衍生物時(shí)發(fā)現(xiàn)，5-甲氧基取代的衍生物具有刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗抑郁活性，并能選擇性的結(jié)合σ受體。TSOYI，et al[5]研究發(fā)現(xiàn)四氫異喹啉類化合物CKD 712（(S)-YS49）可經(jīng)由JAK-2和STAT-1通路發(fā)揮抗炎作用，其在小鼠的炎癥免疫模型（用脂多糖誘導(dǎo)RAW 264.7）中表達(dá)良好的抗炎作用，顯示NO和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶的生成被抑制，對(duì)其異構(gòu)體進(jìn)行構(gòu)效分析研究后發(fā)現(xiàn)其對(duì)i NOS的抑制活性為S型＞R型。李劍[6]研究發(fā)現(xiàn)一種新的四環(huán)化合物四氫吡咯里嗪并喹琳并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)這樣結(jié)構(gòu)的衍生化合物具有較好的鎮(zhèn)痛作用。在此類衍生物的N原子上引入不同取代的酰胺基團(tuán)和不同碳鏈烷基后，設(shè)計(jì)合成一系列的新型四氫吡咯里嗪并喹琳衍生物具有良好的鎮(zhèn)痛活性。

在上述研究的基礎(chǔ)上，筆者的課題組為了尋找抗抑郁、抗炎及鎮(zhèn)痛活性強(qiáng)，副作用低的化合物，設(shè)計(jì)合成了Solifenacin-1801化合物（結(jié)構(gòu)見圖1），對(duì)Solifenacin-1801采用經(jīng)典抗抑郁模型“小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)”和“小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)”進(jìn)行抗抑郁活性研究。另據(jù)研究報(bào)道[7-8]抑郁與體內(nèi)炎癥和疼痛有一定的相關(guān)性。為了探討其相關(guān)性可能的作用機(jī)制，對(duì)Solifenacin-1801化合物采用經(jīng)典的“小鼠二甲苯致耳腫脹的抗炎模型”和“小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)”進(jìn)行抗炎和抗鎮(zhèn)痛研究，以期探討抗抑郁與炎癥和疼痛之前的關(guān)系，初步探討其作用機(jī)制，為抗抑郁藥物的研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

圖1 化合物Solifenacin-1801結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of compound Solifenacin-1801.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

WRS-1B數(shù)字熔點(diǎn)儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司），BS323S精密天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)T-IR1730紅外光譜儀（Bruker公司），AV-300核磁共振光譜儀（Bruker公司），HP1100LC/MS質(zhì)譜儀（美國(guó)惠普公司）。氟西汀，吲哚美辛購(gòu)自Sigma公司，其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠（ICR）20±2 g，購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前，在動(dòng)物室飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件和環(huán)境，晝夜進(jìn)食進(jìn)水。

1.3 Solifenacin-1801的制備路線

1.3.1 (S)-1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉羧酸乙酯的制備

取 12 g（0.06 mol）的(S)-1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉和 8.3 g(0.06 mol)的碳酸鉀，加入到甲苯(45 mL)和蒸餾水(30 mL)(3:2)的混合液中，置于圓底燒瓶中。攪拌條件下，于4℃緩慢滴加氯甲酸乙酯6.5 g(0.06 mol，5.71 mL)。滴畢，室溫條件下反應(yīng)50 min，反應(yīng)過程中使用薄層色譜追蹤反應(yīng)進(jìn)程（展開劑：二氯甲烷（V）：甲醇（V）=30:1）。后處理：甲苯層先后經(jīng) 50 mL 蒸餾水，20 mL的 1 mol·L-1鹽酸，50 mL 蒸餾水，80 mL飽和氯化鈉溶液洗滌。洗滌后的有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，蒸除甲苯。得無色油狀物體 (S)-1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉羧酸乙酯，稱重約15.4 g，計(jì)算產(chǎn)率為95.05%。

1.3.2 Solifenacin-1801的制備

取(S)-1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉羧酸乙酯3.0 g（0.01 mol）與30 mL的甲苯于圓底燒瓶中，油浴加熱至 110～120 ℃，攪拌 2 h。冷卻后將氨芐 5.9 mL（0.05 mol，5.7 g）和 0.42 g（0.02 mol）NaH，加入到上述反應(yīng)體系的圓底燒瓶中，并升溫到130～140℃，不斷蒸除生成的乙醇。乙醇蒸出后，繼續(xù)反應(yīng)15 min，而后冷卻至室溫。反應(yīng)過程中采用薄層色譜追蹤反應(yīng)進(jìn)程（二氯甲烷（V）：甲醇（V）=5:1）。反應(yīng)冷卻至室溫，加入30 mL飽和NaCl溶液，用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層用蒸餾水洗滌，再用10 mL的20%HCl洗滌，用2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至10。用無水硫酸鈉干燥，濃縮濾液。用95%的乙醇重結(jié)晶，得到目標(biāo)化合物 Solifenacin-1801。

1.4 藥理活性實(shí)驗(yàn)

1.4.1 小鼠強(qiáng)迫性游泳實(shí)驗(yàn)（FST）

取雄性小鼠，隨機(jī)分成6組，每組8只?；衔颯olifenacin-1801和陽性對(duì)照藥物鹽酸氟西汀溶于聚乙二醇-400中，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天在各組給藥30 min后，將小白鼠單只放入高為20 cm，直徑為14 cm，水深為10 cm，溫度為23±2℃的圓柱形玻璃容器中，觀察6 min。前2 min時(shí)小鼠劇烈掙扎，隨后進(jìn)入不動(dòng)時(shí)間，此時(shí)由玻璃容器上方直接定位的攝像機(jī)記錄實(shí)驗(yàn)后4 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。通過小鼠浮在水面上不動(dòng)以及僅僅輕微劃動(dòng)肢體以確保頭部浮在水面上所花費(fèi)的時(shí)間認(rèn)定為小鼠的不動(dòng)時(shí)間[9]。

1.4.2 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)（TST）

將小鼠尾部距離尖端2 cm處用尾巴夾鉗固定，懸掛于支架上，頭部距離臺(tái)面5 cm。實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求黑暗，無明顯噪音?？偣矐腋? min，前2 min不計(jì)時(shí)，在測(cè)試的后4 min的時(shí)間內(nèi)，觀察和測(cè)量不動(dòng)的持續(xù)時(shí)間。整個(gè)測(cè)試分別由箱體正上方的攝像記錄觀察，攝像背景與小鼠毛色呈明顯反差，白色小鼠采用黑色背景。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后拿下錄像帶，此時(shí)小鼠的不動(dòng)時(shí)間為它們被懸掛后徹底靜止不動(dòng)的時(shí)間[10]。

1.4.3 抗炎藥理活性

Solifenacin-1801和陽性對(duì)照藥物吲哚美辛溶于聚乙二醇-400，小鼠隨機(jī)分組，雌雄各半，每組8只。實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠進(jìn)行腹腔注射給藥100 mg·kg-1，使用的媒介溶劑和藥物溶液的注射體積均為每只鼠給藥0.1 mL。給藥0.5 h后，小鼠左耳內(nèi)外兩面涂抹二甲苯，用量為0.05 mL·200-1·g-1，為實(shí)驗(yàn)組；右耳朵不涂抹，作為對(duì)照組，小鼠二甲苯致耳腫脹的抗炎模型[11]。炎癥造模15 min后，頸脫臼處死小鼠，使用小鼠耳打孔機(jī)中直徑6 mm的打孔模具分別在同一位置打下小鼠左右雙耳的耳片。記錄其質(zhì)量，計(jì)算腫脹度和腫脹率。以左右兩側(cè)耳片質(zhì)量差作為腫脹程度的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的腫脹程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理?？寡鬃饔脧?qiáng)度以腫脹度和腫脹率(%)表示。

腫脹度=左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量；腫脹率-[(左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量)/左耳重量]×100%

1.4.4 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

小鼠隨機(jī)分組，雌雄各半，一組8只。實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠進(jìn)行腹腔注射給藥。給藥30 min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，腹腔注射1.2%的冰乙酸生理鹽水溶液進(jìn)行疼痛造模[12]，注射劑量為每只鼠0.2 mL(即0.1 mL·10-1·g-1)，觀察并記錄造模后15 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)的扭體現(xiàn)象的次數(shù)。小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的現(xiàn)象為：四肢延伸，腹部收縮內(nèi)凹，臀部扭轉(zhuǎn)的一系列動(dòng)作，只出現(xiàn)了腹部?jī)?nèi)凹收縮和蜷縮成團(tuán)并伴有微微震顫的狀態(tài)不計(jì)為小鼠的扭體反應(yīng)狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)藥物在醋酸致痛模型中對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的抑制率和鎮(zhèn)痛百分率。

抑制率%=（空白組鼠扭體次數(shù)均數(shù)-給藥組鼠扭體次數(shù)均數(shù)）/空白組鼠扭體反應(yīng)均數(shù)×100%

鎮(zhèn)痛百分率%=（給藥組無扭體反應(yīng)數(shù)-空白組無扭體反應(yīng)數(shù)）/空白組扭體反應(yīng)數(shù)×100%

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

抗抑郁活性的定量評(píng)價(jià)采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 Solifenacin-1801光譜數(shù)據(jù)

對(duì)目標(biāo)化合物采用IR、1H-NMR、13C-NMR和MS確定結(jié)構(gòu)，產(chǎn)率和光譜數(shù)據(jù)。產(chǎn)率71.8%，熔點(diǎn)116.4-118.3 °C。IR(KBr)cm-1:3288，1719，1618，1247.1H NMR(CDCl3，300 MHz):δ 2.86-2.98(2H，t，-CH2-)，3.73-3.87(2H，t，-CH2-)，4.48(1H，s，-CH)，6.45(1H，s，-CH)，6.67(1H，s，-NH)，6.90-7.10(4H，m，-C6H4)，6.95-7.31 (5H，m，-C6H5)，7.25-7.40 (5H，m，-C6H5).13C NMR (CDCl3，75 MHz):δ 28.38，40.13，45.10，57.81，126.40，127.17，127.24，127.50，127.65，128.25，128.40，128.48，128.60，135.09，136.52，139.47，142.82，157.49.MS([M+1]+):342.

2.2 抗抑郁活性

小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1?；衔颯olifenacin-1801在三種劑量10，20和30 mg·kg-1均顯著抑制小鼠強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間，顯示一定的抗抑郁活性。Solifenacin-1801在30 mg·kg-1給藥劑量下與空白組比具有顯著性差異（P＜0.001），Solifenacin-1801在20 mg·kg-1給藥劑量下，其抑制率為74.2%，其抑制率與陽性對(duì)照藥氟西汀相似，而Solifenacin-1801在30 mg·kg-1給藥劑量下其抑制率為84.4%，好于陽性對(duì)照藥氟西汀，顯示出顯著抗抑郁活性。

表1 Solifenacin-1801小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)抗抑郁活性Tab.1 Antidepressant activity of Solifenacin-1801 in the FST

為了進(jìn)一步確認(rèn)Solifenacin-1801抗抑郁活性，對(duì)Solifenacin-1801進(jìn)行小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2。Solifenacin-1801小鼠懸尾試驗(yàn)抑制小鼠不動(dòng)時(shí)間結(jié)果與在FST實(shí)驗(yàn)相似。Solifenacin-1801在20和30 mg·kg-1給藥劑量下，其抑制率分別為39.0%和43.1%，其抑制率與陽性對(duì)照藥氟西汀相似，顯示一定的抗抑郁活性。

表2 Solifenacin-1801小鼠懸尾試驗(yàn)抗抑郁活性Tab.2 Antidepressant activity of Solifenacin-1801 in the TST

2.3 Solifenacin-1801抗炎和鎮(zhèn)痛活性

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道抑郁與炎癥和疼痛有一定的相關(guān)，為此，Solifenacin-1801采用小鼠耳腫脹模型和醋酸致痛模型進(jìn)行小鼠的抗炎活性和鎮(zhèn)痛活性評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。Solifenacin-1801在100 mg·kg-1的給藥劑量下，Solifenacin-1801的抗炎率為77.4%，鎮(zhèn)痛率為96.3%，其抗炎抑制活性與陽性藥吲哚美辛相比活性低，而鎮(zhèn)痛活性與陽性對(duì)照藥相似，與空白組相比具有顯著性差異（P＜0.001），顯示一定的抗炎與鎮(zhèn)痛活性。

小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)被動(dòng)接受抑郁癥的兩個(gè)經(jīng)典的應(yīng)激模型，從而誘發(fā)動(dòng)物絕望的狀態(tài)，在小鼠中實(shí)驗(yàn)具有良好的可靠性和預(yù)測(cè)性[13-14]。兩種模式，小鼠都是處于全力掙扎但又無法掙脫的局限壓迫的環(huán)境中，一段時(shí)間后，動(dòng)物即被誘導(dǎo)出小鼠抑郁狀態(tài)的特征行為（行為絕望狀態(tài)-不動(dòng)狀態(tài)），這反過來又可能反映了人類的抑郁癥[15]。一些研究表明，這些急性試驗(yàn)的陽性結(jié)果對(duì)單胺轉(zhuǎn)運(yùn)氧化酶具有良好的、優(yōu)異的預(yù)測(cè)效果，這對(duì)人身上受試抗抑郁藥的治療效果是一個(gè)重要的機(jī)制干擾[16]。

表3 Solifenacin-1801的抗炎和鎮(zhèn)痛活性Tab.3 Anti-inflammatory and analgesic activities of Solifenacin-1801

Solifenacin-1801在3個(gè)劑量（10，20和30 mg·kg-1）條件下給藥30 min后，能夠顯著的降低強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)和懸尾試驗(yàn)中小鼠的不動(dòng)時(shí)間，顯示出顯著的抗抑郁作用，并在10～30 mg·kg-1的劑量下具有以劑量依賴性。我們發(fā)現(xiàn)在100 mg·kg-1給藥劑量下，Solifenacin-1801不僅抗抑郁活性顯著，其同樣還顯示出顯著的抗炎與鎮(zhèn)痛活性，Solifenacin-1801的抗炎率為77.4%，鎮(zhèn)痛率為96.3%。進(jìn)一步說明了Solifenacin-1801的抗抑郁作用機(jī)制，可能還通過炎癥免疫假說的細(xì)胞介質(zhì)傳導(dǎo)或與疼痛抑郁合并癥機(jī)制有關(guān)，起到抗抑郁療效。

Solifenacin-1801顯著的抗抑郁、抗炎鎮(zhèn)痛的生物活性，綜合分析炎性反應(yīng)和疼痛與抑郁癥研究進(jìn)展，免疫炎性反應(yīng)是抑郁癥的發(fā)病機(jī)制之一，炎性過程與部分抑郁癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)，而非全部抑郁癥[17-18]，抑郁癥存在以高炎性狀態(tài)為抑郁標(biāo)志的“亞型”免疫炎性[19]，抗抑郁藥可能大多具有抗感染療效。

3 結(jié)論

本研究以 (S)-1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉為起始原料，經(jīng)成酯和胺解交換反應(yīng)得到目標(biāo)化合物Solifenacin-1801，而后經(jīng)IR、1H-NMR、13C-NMR和高質(zhì)譜確定其結(jié)構(gòu)。

抗抑郁活性實(shí)驗(yàn)表明，Solifenacin-1801在10，20和30 mg·kg-1劑量條件下，均能顯著降低小鼠強(qiáng)迫游泳和小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間，顯示一定的抗抑郁活性。尤其在30 mg·kg-1給藥劑量下，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0.001），其抑制率與陽性對(duì)照藥氟西汀相似，具有很好的抗抑郁活性。

另外，Solifenacin-1801在耳腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)和醋酸致痛實(shí)驗(yàn)顯示，在100 mg·kg-1的給藥劑量下與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0.001），顯示出顯著的抗炎與鎮(zhèn)痛活性，進(jìn)一步證明抑郁與體內(nèi)的炎癥和疼痛有關(guān)。此研究，為尋找炎癥和疼痛誘導(dǎo)引發(fā)的抑郁合并癥類的抗抑郁藥提供了實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。