張周菊, 張 悅, 彭翠香, 孔菲菲, 梁 璐

(湖北省醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司,湖北 武漢430061)

石斛枸杞方由鐵皮石斛、黃精、枸杞子、百合等中藥組成,具有補(bǔ)肺益氣、健脾益氣、補(bǔ)腎填精等功效,用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱、目暗不明,筋骨痿軟等癥。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn),以石斛枸杞方干膏中甘露糖、多糖轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)化水提工藝；以粗多糖總量為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)化黃精、枸杞子、百合提取工藝,以期保證該方質(zhì)量和療效。

1 材料

AB265-S 電子天平(十萬(wàn)分之一)、AL204 電子天平(萬(wàn)分之一) (瑞士Mettler-Toledo 公司)；UV2450 紫外分光光度計(jì)、AT20 高效液相色譜儀(日本島津公司)；Thermo Scientific ST16R 離心機(jī)；Eppendoff Reseach Plus 移液器。D-甘露糖 (批號(hào)140651-201504)、 D-無(wú)水葡萄糖 (批號(hào)110833-201506) 對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。鐵皮石斛由湖北英山縣紫楹石斛產(chǎn)業(yè)有限公司惠贈(zèng),經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳科力教授鑒定為蘭科植物石斛屬植物鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo；黃精、百合、枸杞子均購(gòu)自湖北格林藥業(yè)有限公司,經(jīng)專家鑒定為正品,均符合2015 年版《中國(guó)藥典》 一部項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 工藝設(shè)計(jì) 由于鐵皮石斛所含成分不易煎出,故將其單獨(dú)水煎煮提取,而黃精、百合、枸杞子合并后水煎煮提取。

2.2 甘露糖含有量測(cè)定

2.2.1 色譜條件［1］填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨(26 ∶74)；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。理論塔板數(shù)以甘露糖峰計(jì),應(yīng)不低于4 000。

2.2.2 校正因子測(cè)定 精密稱取鹽酸氨基葡萄糖適量,加水制成每1 mL 含12 mg 該成分的溶液,作為內(nèi)標(biāo)溶液。另精密稱取甘露糖對(duì)照品約10 mg,置于100 mL 量瓶中,精密加入1 mL 內(nèi)標(biāo)溶液,加適量水溶解并稀釋至刻度,搖勻,吸取400 μL,加0.5 mol/L PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮) 甲醇溶液、0.3 mol/L 氫氧化鈉溶液各400 μL,混勻,70 ℃水浴反應(yīng)100 min,再加入0.3 mol/L 鹽酸溶液500 μL,混勻,三氯甲烷洗滌3 次,每次2 mL,水層離心,取上清液10 μL,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算校正因子。

2.2.3 供試品溶液制備 取提取物適量,置于100 mL 量瓶中,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL,加水至刻度,搖勻,離心,吸取上清液1 mL, 置于安瓿瓶或頂空瓶中, 加3.0 mol/L鹽酸溶液0.5 mL,封口,混勻,110 ℃水解1 h,放冷,3.0 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至中性,吸取400 μL,按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作,取上清液10 μL,即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取甘露糖適量,置于100 mL量瓶中,配制0.5 mg/mL 貯備液,精密吸取0.2、0.4、1、2、3、4 mL 至10 mL 量瓶中,制備0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL 對(duì)照品溶液,精密加入“2.2.2”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL,在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,得方程為Y ＝11.765X+0.052 3(r＝0.999 5),在10.1 ～202.1 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 粗多糖含有量測(cè)定［2］

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量,加水制成每1 mL 含90 μg 該成分的溶液,精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于10 mL 具塞試管中,加水至1.0 mL,精密加入5%苯酚溶液1 mL(臨用配制),搖勻,再精密加入硫酸5 mL,搖勻,沸水浴中加熱20 min,取出,冰浴中冷卻5 min。以相應(yīng)試劑為空白,采用紫外-可見(jiàn)分光光度法(《中國(guó)藥典》附錄VA)在488 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以其為縱坐標(biāo)(A),溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸,得方程為A＝0.009 2X+0.002 7(r＝0.999 5),在20.92～104.6 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 甘露糖HPLC 色譜圖

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取干浸膏適量,加水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中,加水至刻度,搖勻,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液液2 mL,置于15 mL 離心管中,加10 mL 無(wú)水乙醇,搖勻,冷藏1 h,取出離心,棄去上清液,沉淀用80%乙醇洗滌2 次,每次8 mL,棄去上清液,沉淀加水溶解,轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中,稀釋至刻度,搖勻。精密吸取1 mL,置于10 mL 具塞試管中,按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,計(jì)算多糖含有量(以D-無(wú)水葡萄糖計(jì))。

2.4 鐵皮石斛水提工藝優(yōu)化

2.4.1 吸水量考察 稱取藥材粗粉15 g,加入500 mL 水?dāng)嚢?浸泡1 h 后濾過(guò),得未被吸收的水液280 mL。結(jié)果,15 g 藥材粗粉吸水量為220 mL,即約為14.6 倍,故本實(shí)驗(yàn)先加入15 倍量水補(bǔ)足藥材吸水量。

2.4.2 優(yōu)化方法 稱取藥材粗粉9 份,每份20 g,以多糖、甘露糖轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo),浸泡時(shí)間(A,提取前加15 倍量水,根據(jù)各組設(shè)定時(shí)間浸泡)、加水量(B)、提取時(shí)間(C) 作為影響因素,L9(34) 正交試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝。因素水平、結(jié)果、方差分析分別見(jiàn)表1～3。

表1 鐵皮石斛水提工藝因素水平

表2 鐵皮石斛水提工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 鐵皮石斛水提工藝方差分析

由表可知,各因素影響程度依次為C＞B＞A,即浸泡時(shí)間(A) 對(duì)轉(zhuǎn)移率影響最小,故選擇1 h,而提取時(shí)間(C) 有顯著影響(P＞0.05)。因此,確定最優(yōu)工藝為鐵皮石斛粗粉加15 倍量水補(bǔ)足吸水量后浸泡1 h,提取3 次,每次加12 倍量水。

2.5 枸杞、百合、黃精水提工藝優(yōu)化

2.5.1 吸水量考察 稱取3 味藥材共78 g,加入500 mL水浸泡至藥材全部浸透,濾過(guò),得未被吸收的水液340 mL。結(jié)果,78 g 藥材粗粉吸水量為160 mL,即約為2 倍,故本實(shí)驗(yàn)先加入2 倍量水補(bǔ)足藥材吸水量。

2.5.2 優(yōu)化方法 按處方比例稱取3 味藥材9 份,每份130 g,以粗多糖含有量為指標(biāo),加水量(A)、浸泡時(shí)間(B)、提取時(shí)間(C) 作為影響因素,L9(34) 正交試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝。因素水平、結(jié)果、方差分析分別見(jiàn)表4～6。

表4 枸杞、百合、黃精水提工藝因素水平

由表可知,各因素影響程度依次為B＞A＞C,以加水量(A)、浸泡時(shí)間(B) 更顯著(P＜0.05)。因此,確定最優(yōu)工藝為3 味藥材加2 倍量水浸泡1 h 后,12 倍量水提取2次,每次6 倍量,提取時(shí)間分別為2、1 h,實(shí)際提取時(shí),將補(bǔ)足吸水量所需2 倍量水與第一次提取所需6 倍量水合并加入浸泡,即加8 倍量水浸泡1 h 后進(jìn)行第1 次提取。

2.6 鐵皮石斛水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取藥材60 g,按“2.4.2” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝提取,重復(fù)3 次。結(jié)果,收膏率為38.13%,多糖含有量為 57.70%, 轉(zhuǎn)移率為 61.79%(RSD＝1.30%)； 甘露糖含有量為32.69%, 轉(zhuǎn)移率為61.47% (RSD＝1.99%),表明工藝穩(wěn)定可行。

2.7 枸杞子、黃精、百合水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方比例稱取3 味藥材共390 g,按“2.5.2” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝提取,重復(fù)3 次。結(jié)果,收膏率為42.14%；粗多糖含有量為68.84%,總量為107.178 g(RSD＝2.30%),表明工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

中藥提取一般采用分次方式,理論上增加浸提次數(shù)可提高藥材成分浸出總收率,但浸提次數(shù)越多,收率愈低,而且會(huì)盲目增加提取時(shí)間,造成能量消耗、勞動(dòng)力投入加大,從而使得生產(chǎn)成本增加［3］,故中藥提取工藝研究一般要考察提取次數(shù)。但在正交試驗(yàn)中,提取次數(shù)作為影響因素會(huì)改變其他因素水平,使原本四因素三水平變?yōu)樗囊蛩囟嗨?不符合均勻分散、整齊可比的性質(zhì)［4-5］,而且直接造成總?cè)軇┝窟^(guò)大、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等問(wèn)題,導(dǎo)致優(yōu)選工藝參數(shù)不符合實(shí)際生產(chǎn)。

表5 枸杞、百合、黃精水提工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 枸杞、百合、黃精水提工藝方差分析

近年來(lái),已有較多文獻(xiàn)將提取次數(shù)單獨(dú)考察,而不納入正交試驗(yàn)中［6-11］,這樣加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間均為3 個(gè)水平,不會(huì)因?yàn)樵撘蛩赜绊懚霈F(xiàn)多個(gè)水平,安排合理,不違反試驗(yàn)特性。一般情況下,根莖類藥材提取2～3 次時(shí)基本上可將70%～80%成分提取到溶劑中［12］,故本實(shí)驗(yàn)設(shè)置提取次數(shù)1、2、3 次,然后將其與提取時(shí)間合并作為1 個(gè)因素,這樣既避免了該因素對(duì)其他因素的影響,又可在不增加試驗(yàn)次數(shù)的前提下同時(shí)對(duì)其進(jìn)行考察。

4 結(jié)論

鐵皮石斛最優(yōu)水提工藝為藥材加15 倍量水補(bǔ)足吸水量后浸泡1 h,加水量36 倍(提取3 次,每次12 倍量),提取時(shí)間6 h(每次2 h)；黃精、枸杞子、百合最優(yōu)水提工藝為加2 倍量水補(bǔ)足吸水量后浸泡1 h,加水量12 倍(提取2 次,每次6 倍量),提取時(shí)間3 h(第1 次2 h,第2 次1 h)。經(jīng)驗(yàn)證、小試、中試放大試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),所測(cè)指標(biāo)均較穩(wěn)定,表明工藝穩(wěn)定可行。