呂珍珍, 彭 帥, 趙碧清, 周小江*

(1.湖南中醫(yī)藥大學,湖南長沙410208；2.湖南省中藥飲片標準化及功能工程技術研究中心,湖南長沙410208；3.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西 南寧530201)

內生真菌是指那些在其生活史的某一段時期生活在植物組織內,對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌［1］。研究表明,幾乎所有被研究過的植物均發(fā)現(xiàn)了內生真菌,目前自然界至少有100 多萬種內生真菌［2-3］,產生了萜類、生物堿類、苯丙素類、黃酮類、甾體類、醌類、糖類、有機酸類、肽類等多種結構類型次生代謝產物,并且具有抗腫瘤、抗菌、 抗氧化、 抗病毒、 抗炎、 殺蟲等活性［4-5］。因此,植物內生真菌成為了尋找活性物質的良好資源。

花椒屬植物屬于蕓香科,我國約有39 種14 變種［6］,其中野花椒Zanthoxylum simulans Hance 為該屬藥食兩用品種之一,其果實常作為調味品使用［7］,而其干皮及枝皮為湖南省有名的祛風濕中藥,叫麻口皮子藥或皮子藥,用于治療風寒濕痹、腹痛泄瀉、咽喉疼痛等?。?］。關于野花椒的化學成分及其抗類風濕關節(jié)炎活性已有研究報道,基本揭示了麻口皮子藥抗類風濕關節(jié)炎的物質基礎［9-12］,并且對其中抗類風濕關節(jié)炎的內生真菌進行了篩選,得到4 株活性菌株［13］。為了更廣泛地尋找抗類風濕關節(jié)炎的活性物質,本實驗繼續(xù)對麻口皮子藥內生真菌及其次生代謝產物進行研究,從中分離鑒定了一株優(yōu)勢內生真菌Pestalotiopsis oxyanthi,并從其發(fā)酵物中分離得到了7 個次生代謝產物,均為首次從該內生真菌中分離得到。

1 材料

DRP-600 MHz 核磁共振波譜儀(TMS 為內標,德國Bruker 公司)；Xevo G2-XS QTof 高分辨質譜儀(美國Waters 公司)；Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)；N-1001 型旋轉蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)。培養(yǎng)基采用PDA固體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)液和大米培養(yǎng)基(實驗室配制)。Sephadex LH-20 型羥丙基葡聚糖凝膠(美國Amersham Biosciences 公司)；Rp-18 反相硅膠(40～63 μm,日本Daiso 公司)；MCI gel CHP-20P(日本三菱化學株式會社)；ReproSil 100-C18色譜柱(250 mm×10 mm,5 μm,德國邁克公司)；柱色譜硅膠(200～300 目)、硅膠H、薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠)；其他試劑均為分析純。

麻口皮子藥于2016 年10 月采自湖南省瀏陽市大圍山,封存于保鮮袋中,經湖南中醫(yī)藥大學藥學院周小江教授鑒定為蕓香科花椒屬植物野花椒Zanthoxylum simulans Hance 的新鮮干皮。

2 方法

2.1 內生真菌分離與純化 取新鮮麻口皮子藥干皮,用蒸餾水沖洗數(shù)次直至干凈,剪成邊長約2 cm的方塊,依次用75%酒精、無菌水、5%次氯酸鈉溶液、無菌水進行漂洗,時間分別為1 min、30 s、3 min、45 s,將消毒后的干皮于無菌操作臺中剪切成邊長1 cm 的小塊,置PDA-抗生素平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),對照組為消毒后邊長2 cm 的方塊,于培養(yǎng)箱中恒溫30 ℃培養(yǎng)7 d 左右,將干皮剪切邊緣長出的菌絲接種至PDA 平板培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),采用平板劃線法進行反復分離純化,直至培養(yǎng)基中的菌落為單一菌株。其中,菌株MK-24 為優(yōu)勢菌株,將優(yōu)勢菌株保存于斜面培養(yǎng)基中,以5 ～7 ℃的溫度保種備用。

2.2 內生真菌鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定［13］將MK-24 于PDA 平板上30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 左右,觀察菌落生長情況,記錄菌株培養(yǎng)特性,采用插片法對菌株進行顯微攝影,觀察其顯微形態(tài)特征,依據薩卡圖和休斯-塔巴基-巴倫真菌分類系統(tǒng)進行初步鑒定和分類。

2.2.2 分子鑒定 對優(yōu)勢內生真菌MK-24 進行分子鑒定,DNA 提取采用CTAB 法［15］, 通用引物ITS1/ITS4 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′), ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 擴增ITS 1、5.8S 和ITS2 的全序列,PCR 反應體系與PCR 循環(huán)體系見表1～2,將PCR 產物送上海生工生物工程有限公司測序。將所測得真菌的ITS 序列在GenBank 數(shù)據庫中進行BLAST 比對分析(https： //www.ncbi.nlm.nih.gov/),搜索同源序列,將序列相似性大于95%的rDNA ITS 序列通過MEGA7.0 軟件使用Clustal W 進行多重比對,構建系統(tǒng)進化樹進行分析。

表1 PCR 反應體系Tab.1 Reaction systems of PCR

表2 PCR 循環(huán)體系Tab.2 Circulation systems of PCR

2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將保存于PDA 斜面培養(yǎng)基的菌株MK-24 接種到PDA 平板培養(yǎng)基上于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后,接種到麥芽種子培養(yǎng)液中進行搖床活化,條件為28 ℃、180 r/min。將活化后的菌株接種至大米培養(yǎng)基中進行發(fā)酵,常溫下靜置40 d。

2.4 提取與分離 菌株發(fā)酵結束后,往瓶中加入丙酮沒過菌絲體,靜置12 h 以殺死真菌,然后將大米搗碎,4 層紗布過濾得發(fā)酵液,將發(fā)酵液減壓濃縮至3 L 以下,用乙酸乙酯超聲提取2 次,每次20 min,濾過,合并濾液,減壓回收乙酸乙酯,得浸膏92 g。浸膏過硅膠柱,以石油醚-乙酸乙酯(5 ∶1、3.5 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶4)梯度洗脫,收集洗脫液,每份約500 mL,薄層色譜檢識,合并為4 部分(Fr.1 ～Fr.4)。Fr.3(12.5 g) 過MCI柱,以甲醇-水(30 ∶70、40 ∶60、50 ∶50、60 ∶40、70 ∶30、80 ∶20、90 ∶10、甲醇) 梯度洗脫,檢識,合并成3 個部分(Fr.3-1 ～Fr.3-3),Fr.3-1(3.7 g) 經反相硅膠以甲醇-水(30 ∶70、40 ∶60、50 ∶50、60 ∶40、70 ∶30、80 ∶20、90 ∶10、甲醇) 梯度洗脫,Sephadex LH-20 柱甲醇洗脫純化,得化合物1(1.3 mg)、4(78.4 mg), Fr.3-1-3(2.3 g) 先過反相硅膠, 以甲醇-水 (30 ∶70、40 ∶60、50 ∶50、60 ∶40、70 ∶30、80 ∶20、90 ∶10、甲醇) 梯度洗脫,Sephadex LH-20 柱甲醇洗脫純化,再經制備HPLC 色譜(甲醇∶水＝34 ∶66)純化,得化合物2(1.6 mg)、3(1.9 mg),Fr.3-1-2(0.8 g)經Sephadex LH-20 柱甲醇洗脫純化,得化合物5(6.1 mg)；Fr.1(20.6 g) 先過正相硅膠柱,以石油醚-乙酸乙酯(20 ∶1、15 ∶1、10 ∶1、8 ∶1、6 ∶1、5 ∶1) 梯度洗脫,再經反相硅膠柱,以甲醇-水(30 ∶70、40 ∶60、50 ∶50、60 ∶40、70 ∶30、80 ∶20、90 ∶10、甲醇) 梯度洗脫,制備薄層 (展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯,10 ∶1),Sephadex LH-20 柱(三氯甲烷-甲醇,6 ∶4) 洗脫純化,得化合物6(8.7 mg)、7(2.3 mg)。

3 結果

3.1 內生真菌鑒定 MK-24 在PDA 培養(yǎng)基上菌落呈白色絨毛狀并出現(xiàn)輪紋,中部淡黃褐色見圖1a,7 d 后長滿直徑10 cm 的培養(yǎng)基,菌絲生長較迅速,14 d 后菌落上出現(xiàn)孢子堆,有油滴,培養(yǎng)基背面為桔黃色且有皺褶見圖1b。顯微觀察發(fā)現(xiàn),菌絲無色,有分枝,具隔膜見圖1c,分生孢子紡錘形,(14.0～26.0)μm×(6.0 ～8.0)μm,可見3 個深色細胞,見圖1d。ITS 序列分析表明,內生真菌MK-24 與Pestalotiopsis oxyanthi(最大相似度99%,覆蓋度100%,登錄號KT716303.1) 非常接近,其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。結合其菌絲與分生孢子特征,初步將菌株MK-24 鑒定為P.oxyanthi。

圖1 MK-24 菌株形態(tài)與顯微結構特征Fig.1 Colony morphology and microscopic characteristic of MK-24 strain

3.2 結構鑒定

圖2 MK-24 菌株基于ITS 序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of MK-24 strain generated from the ITS sequences

化合物1：淺粉色粉末。分子式C8H8O4。HRESI-Q-TOF-MS m/z：167.038 7 ［M-H］-。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ：7.42(1H,d,J ＝2.0 Hz,H-2),7.41(1H,dd,J ＝8.6,2.0 Hz,H-6),6.80(1H,d, J ＝8.6 Hz, H-5), 3.83 (3H, s, 7-OCH3)；13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ：168.8(C-7),151.7(C-4),146.2(C-3),123.6(C-6),122.5(C-1),117.4(C-5),115.8(C-2),52.2(7-OCH3)。以上數(shù)據與文獻［14］ 基本一致,故鑒定為3,4-二羥基苯甲酸甲酯。

化合物2：白色粉末。分子式C10H14O3。HRESI-Q-TOF-MS m/z：181.088 0 ［M-H］-。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ：6.87(1H,d,J ＝8.2 Hz,H-5),6.84(1H,d,J ＝2.0 Hz,H-2),6.76(1H,dd,J ＝2.0,8.2 Hz, H-6),3.82 (3H, s,4-OCH3),3.79(3H,s,3-OCH3),3.72(2H,t,J ＝7.1 Hz,H-8),2.76(2H,t,J ＝7.1 Hz,H-7)；13CNMR(150 MHz,CD3OD)δ：150.5(C-3),148.9(C-4),133.3(C-1),122.3(C-6),114.0(C-2),113.1(C-5),64.4(C-8),56.5(3-OCH3),56.4(4-OCH3),39.8(C-7)。以上數(shù)據與文獻［15］基本一致,故鑒定為3,4-二甲氧基苯乙醇。

化 合 物 3： 針 狀 結 晶 (甲 醇)。 分 子 式C13H16O7。HR-ESI-Q-TOF-MS m/z：285.096 9［M+H］+。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ：6.71(1H,d,J ＝1.1 Hz,H-2′),6.57(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-5),5.75(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-3),4.26(1H,dd,J ＝4.2,11.4 Hz,H-1″a),4.16(1H,dd,J ＝6.4,11.4 Hz,H-1″b),3.90(3H,s,4-OCH3),3.88(1H,m,H-2″),3.59(2H,dd,J ＝1.2,5.5 Hz,H-3″),2.39(3H,d,J ＝1.1 Hz,1′-CH3)；13CNMR(150 MHz,CD3OD)δ：172.9(C-4),167.3(C-3′),165.6(C-2),160.3(C-6),144.1(C-1′),121.0(C-2′),104.1(C-5),91.3(C-3),71.1(C-2″),66.7(C-1″),64.0(C-3″),57.2(4-OCH3),13.6(1′-CH3)。以上數(shù)據與文獻 ［16］基本一致, 故鑒定為 (2E) -(2R) -2, 3-dihydroxypropyl-3-(4-methoxy-2-oxo-2H-pyran-6-yl) -2-butenoic acid ester。

化合物4：針狀結晶(甲醇)。分子式C8H10O2。HR-ESI-Q-TOF-MS m/z： 137.060 1 ［M-H］-。1HNMR(600 MHz,CD3OD)δ：7.02(2H,d,J ＝8.5 Hz,H-3,5),6.72(2H,d,J ＝8.5 Hz, H-2,6),3.69(2H,t,J ＝7.4 Hz,H-8),2.71(2H,t,J ＝7.4 Hz,H-7)；13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ：156.6(C-4), 130.9 (C-1), 130.8 (C-2, 6),116.1(C-3,5),64.5(C-8),39.3(C-7)。以上數(shù)據與文獻［17］ 基本一致,故鑒定為對羥基苯乙醇。

化合物5：白色粉末。分子式C11H18O4。HRESI-Q-TOF-MS m/z：213.112 1 ［M-H］-。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ：5.18(1H,d,J ＝1.7 Hz,H-3), 4.36 (1H, m, H-6), 3.81 (3H, s, 4-OCH3),3.60(1H,m,H-1′),2.84(1H,m,H-5b),2.31(1H,dd,J ＝3.8,17.2 Hz,H-5a),1.61(2H,m,H-2′),1.51(2H,m,H-3′),1.37(2H,m,H-4′),0.94(3H,t,J ＝7.1 Hz,H-5′)；13C-NMR(150 MHz, CD3OD) δ：176.5(C-2), 170.3 (C-4), 90.0 (C-3), 80.2 (C-1′),72.6(C-6),57.3(4-OCH3),33.3(C-5),30.2(C-2′), 29.1 (C-3′), 23.7 (C-4′), 14.4 (C-5′)。以上數(shù)據與文獻［18］ 基本一致,故鑒定為(6S) -6-［(1S) -1-羥基戊基］ -4-甲氧基-5,6-二氫吡喃-2-酮。

化合物6：白色粉末。分子式C29H50O。HRESI-Q-TOF-MS m/z：415.211 9［M+H］+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ：5.35(1H,t,J ＝2.3 Hz,H-6),3.52(1H,m,H-3),1.00(3H,s,H-29),0.92(3H,d,J ＝6.5 Hz,H-19),0.84(3H,t,J ＝7.4 Hz,H-24),0.83(3H,d,J ＝6.8 Hz,H-26),0.81(3H,d,J ＝6.8 Hz,H-27),0.68(3H,s,H-28)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ：140.9(C-5),121.9(C-6),72.0(C-3),56.9(C-14),56.2(C-17),50.2 (C-9), 45.9 (C-22), 42.4 (C-13),42.4(C-4),39.9 (C-12), 37.4 (C-1),36.6(C-10),36.3(C-18),34.0(C-20),32.0(C-7),32.0(C-8),31.8(C-2),29.2(C-25),28.4(C-16),26.1(C-15),24.4(C-21),23.2(C-23),21.2(C-11),19.9(C-26),19.5(C-27),19.2(C-19),18.9(C-28),12.1(C-24),12.0(C-29)。以上數(shù)據與文獻［19］ 基本一致,故鑒定為β-谷甾醇。

化合物7：白色粉末。分子式C29H48O。HRESI-Q-TOF-MS m/z：413.378 2［M+H］+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ：5.73(1H,s,H-4),1.18(3H,s,H-19),0.90(3H,J ＝6.5 Hz,H-21),0.84(3H,m,H-29),0.83(3H,d,J ＝6.8 Hz,H-26),0.81 (3H,d,J ＝6.8 Hz,H-27),0.71(3H,s,H-18)；13C-NMR(150 MHz, CDCl3) δ：199.9(C-3),172.0(C-5),123.9(C-4),56.1(C-17),56.0 (C-14),53.9 (C-9),45.4 (C-24),42.4(C-13),39.7(C-12),38.7(C-10),36.3(C-20), 35.8 (C-1), 35.7 (C-8), 34.2(C-22),34.0(C-2),33.1(C-6),32.2(C-7),29.2(C-25),28.3(C-16),26.1(C-23),24.3(C-15),23.2(C-28),21.2 (C-11),20.0 (C-26),19.1(C-27),18.8(C-21),17.5(C-19),12.1(C-29),12.1 (C-18)。 以 上 數(shù) 據 與 文 獻［20］ 基本一致,故鑒定為豆甾-4-烯-3-酮。

4 討論

P.oxyanthi 為擬盤多毛孢屬內生真菌,這是首次從麻口皮子藥中分離得到的,而文獻［21］報道擬盤多毛孢屬內生真菌能產生抗宮頸癌及結腸癌的活性成分。因此,本研究對此內生真菌的次生代謝產物研究具有重要的意義。

目前,從P.oxyanthi 次生代謝產物中所分離的化合物均為首次得到,但僅為此內生真菌次生代謝產物的一部分,目前還未見抗類風濕關節(jié)炎的報道。其中的3,4-二羥基苯甲酸甲酯為酚酸類化合物,文獻［22］ 報道它具有抗炎、抗菌、抗癌等藥理作用。

優(yōu)勢菌株是指在1 個生態(tài)環(huán)境中占主導地位的菌種, 在分離麻口皮子藥內生真菌過程中, P.oxyanthi 是生長最快、數(shù)量最多的菌種,而植物內生真菌是尋找活性物質的良好來源,因此選擇其進行次生代謝產物研究。同時,抗類風濕關節(jié)炎活性成分的篩選是下一步研究目標。