周 寧, 鄭曉珂*, 李 凱,2, 牛 艷, 李星燦, 匡海學, 馮衛(wèi)生,2*

(1.河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 鄭州450046；3.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱150040)

《素問·調(diào)逆論》云： “腎者,水臟,主津液”［1］,腎接納津液后分清與濁,清者蒸騰向上達于肺而濡養(yǎng)全身,濁者氣化向下注入膀朧而排出體外,“腎主水” 異常會導致機體水液代謝失調(diào),進而形成水腫［2］。在正常生理狀態(tài)下,機體之腎陰與腎陽相對平衡,故無論是腎陰還是腎陽虧竭,均會導致“腎主水” 之功能異常,從而引起機體水液代謝障礙,并誘發(fā)水腫,腎陰虧虛則陰虛火旺、代謝亢進,而腎陽虧虛則陽氣不足、代謝滯緩。

課題組前期已經(jīng)通過“阿霉素+甲狀腺片” 的復合造模法建立腎陰虛水腫模型［3］,并進行相關(guān)代謝組學研究,得到其代謝輪廓特征、相關(guān)生物標志物、受干擾的代謝通路和網(wǎng)絡［4］；本實驗擬采用“阿霉素+氫化可的松” 復合造模法建立腎陽虛水腫模型［5］,以期從代謝組學的角度初步揭示其發(fā)病機理,并通過比較病理變化、代謝異常、共有標志物水平在腎陰虛、陽虛水腫模型中變化趨勢的異同,篩選出可用于區(qū)分2 種證型的潛在生物標志物,從而為中醫(yī)辯證研究提供新思路。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠,體質(zhì)量180 ～220 g,雄性,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號SCXK(京) 2012-0001,均飼養(yǎng)于(20±2)℃、相對濕度(60±10)%的清潔級動物實驗室內(nèi),晝夜交替,自由攝食飲水。

1.2 試藥 阿霉素注射粉末(山西普德藥業(yè)股份有限公司,批號02160103)；氫化可的松注射液(上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)股份有限公司, 批號1502132)；桂附地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠,批號15050630)。0.9%生理鹽水 (河南科倫藥業(yè)有限責任公司, 批號H20003438)；乙腈為色譜純(美國Fisher Chemical公司)； 甲酸為質(zhì)譜純 (美國Anaqua Chemicals Supply 公司)。

1.3 儀器 maXis HD 四級桿-飛行時間質(zhì)譜(德國Bruker 公司)；Dionex UltiMate 3000 超高效液相色譜儀(美國Thermo Scientific 公司)；iMark 酶標儀(美國Bio-Rad 格式)。

2 方法

2.1 分組與造模 30 只大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后,隨機分成正常組(8 只) 和造模組(22 只),其中造模組大鼠第1 天尾靜脈注射4 mg/kg 阿霉素,第8 天尾靜脈注射3.5 mg/kg 阿霉素,同時開始腹腔注射氫化可的松,連續(xù)15 d,造模結(jié)束后將成模大鼠分成腎陽虛水腫模型組和陽性藥組。正常組、模型組大鼠給予蒸餾水(1 mL/100 g),而陽性藥組大鼠給予桂附地黃丸混懸液(4.38 mg/kg)。

2.2 樣品采集與處理 代謝籠收集各組大鼠24 h尿液,10%水合氯醛麻醉后腹主動脈取血,分別收集血清、血漿,置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存。進樣前,尿液在冰水浴下解凍,12 000 r/min離心10 min,將1 mL 上清液與3 倍量乙腈混合后渦旋60 s,12 000 r/mim 再離心10 min,吸取適量上清液于進樣瓶中,進行UPLC-Q/TOF-MS 分析。

2.3 一般狀況觀察與生化指標檢測 觀察大鼠的身體狀態(tài)和一般行為特征,同時檢測各組大鼠尿蛋白及血中環(huán)磷酸腺苷 (cAMP)、 環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、肌酐、尿素氮、白蛋白水平,進而對腎陽虛水腫模型的建立進行評價。

2.4 液質(zhì)分析條件

2.4.1 色譜條件 色譜分離采用AcclaimTMRSLC 120 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.2 μm)；進樣量2 μL；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；流動相0.1%甲酸-水(A) 和乙腈(B),梯度洗脫(0 ～1 min,2 ～10% B；1 ～9 min,10 ～20% B；9 ～16 min,20～30%B；16～20 min,30～98%B)。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源(ESI),正、負離子源模式下毛細管電壓分別為3 500、3 200 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 500；霧化氣壓、干燥氣溫度和干燥氣體積流量分別為200 kPa、230 ℃和8 L/h。

2.5 代謝輪廓分析 利用Q/TOF-MS 配套軟件Data Analysis 2.1 對原始譜圖數(shù)據(jù)進行濾噪、校正和峰對齊,將處理后的數(shù)據(jù)在Profile Analysis 軟件中打開,進行歸一化處理和bucket 列表生成,再將bucket 列表導入SIMCA-P 13.0 軟件進行主成分分析(PCA),所得PCA 得分散點圖可直觀反映各實驗組大鼠之間的代謝輪廓差異［6］。

2.6 生物標志物篩選與鑒定 在主成分分析基礎(chǔ)上進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA),生成OPLS-DA 得分散點圖、S-plot 散點圖、VIP 列表,利用t 檢驗(P＜0.05) 和VIP 值(VIP＞1.5)對潛在生物標志物進行初步篩選, 結(jié)合Metlin、HMDB、KEGG 等在線數(shù)據(jù)庫作進一步地鑒別。最后,通過MeV 軟件繪制生物標志物水平量化處理結(jié)果的熱度圖。

2.7 代謝通路富集分析與網(wǎng)絡構(gòu)建 將潛在生物標志物導入MBRole 數(shù)據(jù)庫 (http： //csbg.cnb.csic.es/mbrole2) 進行代謝通路富集分析,獲得顯著受到干擾的代謝通路,再結(jié)合KEGG(http： //www.kegg.jp/) 等在線數(shù)據(jù)庫的相關(guān)信息構(gòu)建腎陽虛水腫模型受干擾的代謝網(wǎng)絡。

3 結(jié)果與討論

3.1 一般狀況與生化指標 模型組大鼠出現(xiàn)脫毛、毛色無光、牙齒脫落、不愛動、怕冷、便溏等腎陽虛癥狀,而給予陽性藥后上述癥狀均得到顯著改善［7］。血中cAMP、cGMP 水平及比值變化是區(qū)分腎陰虛、陽虛證的關(guān)鍵指標［3］,表1 顯示,與正常組比較,腎陽虛水腫模型組大鼠cAMP 水平顯著降低(P＜0.01)、cGMP 水平顯著升高(P ＜0.05),兩者比值降低,而給予陽性藥后比值顯著升高,表明造模成功［8-9］。血肌酐和尿素氮能客觀地反映腎小球濾過率,是臨床上評估腎功能損傷的常規(guī)指標［10］,表1 顯示,腎陽虛水腫模型組大鼠血肌酐、尿素氮、尿蛋白水平較正常組均顯著升高 (P ＜0.05,P＜0.01),同時出現(xiàn)低蛋白血癥,而給予陽性藥后各項指標均得到不同程度的改善,表明大鼠腎功能受損并伴有水腫癥狀。

3.2 代謝輪廓 對尿液分析條件進行優(yōu)化后,得到具有最優(yōu)分離度和峰形的基峰色譜圖,見圖1。

圖2A 顯示,正常組、腎陽虛水腫模型組樣品在PCA 得分散點圖中各自聚為一類,2 組分離趨勢明顯,表明模型大鼠體內(nèi)代謝水平發(fā)生明顯波動,偏離正常狀態(tài)。圖2B 顯示,陽性藥組樣本點與正常組聚為一類,進一步確認造模成功。

表1 3 組生化指標比較，n=6）Tab.1 Comparison of biochemical indices among the three groups，n=6）

表1 3 組生化指標比較，n=6）Tab.1 Comparison of biochemical indices among the three groups，n=6）

注：與正常組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與腎陽虛水腫模型組比較,＃＃P＜0.01

組別 (n cmAoMl·PL-/1)(n cmGoMl·PL/-1)(m尿g·蛋24白 h-/1)(白g·蛋L白-1)/(μm肌o酐l·L/-1)(m尿m素ol·氮L-/1)正常組 35.40±1.01 10.72±0.74 6.20±1.88 32.81±1.82 29.17±5.98 5.78±0.42腎陽虛水腫模型組 27.84±2.41** 11.84±0.89* 212.21±91.00** 23.20±0.66** 50.77±4.08** 7.20±0.92*陽性藥組 28.32±2.63 9.45±0.87＃＃ 175.07±53.29 23.58±0.91 34.05±5.96＃＃ 5.44±0.69＃＃

圖1 尿液基峰色譜圖Fig.1 Base peak chromatograms of urine

3.3 腎陽虛水腫模型相關(guān)生物標志物 圖2C 顯示,正常組、腎陽虛水腫模型組樣品在OPLS-DA得分散點圖中明顯分離,與其對應的S-Plot 散點圖(圖2D) 中菱形標志為P＜0.05 且VIP＞1.5 的代謝物,距離原點越遠的代謝物對組間差異貢獻度越大。結(jié)合HMDB、KEGG 等在線數(shù)據(jù)庫,最終鑒定40 個相關(guān)生物標志物,其中負源模式下21 個,正源模式下19 個,見表2。圖3 顯示,與正常組比較,腎陽虛水腫模型組標志物水平有21 個呈上調(diào)變化,19 個呈下調(diào)變化。

3.4 腎陽虛水腫模型相關(guān)代謝通路 將表2 生物標志物導入MBRole 數(shù)據(jù)庫進行代謝通路得富集分析,結(jié)果見表3,可知大鼠體內(nèi)受到顯著干擾的代謝通路有苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、嘧啶代謝。

圖2 樣品散點圖Fig.2 Scatter plots for samples

表2 腎陽虛水腫模型相關(guān)生物標志物Tab.2 Relevant biomarkers for edema model of Kidney Yang Deficiency

續(xù)表2

圖3 生物標志物熱度圖Fig.3 Heatmap for biomarkers

表3 腎陽虛水腫模型相關(guān)代謝通路Tab.3 Relevant metabolic pathways for edema model of Kidney Yang Deficiency

3.5 腎陽虛水腫模型相關(guān)代謝網(wǎng)絡 在代謝通路富集分析的基礎(chǔ)上,結(jié)合KEGG 在線數(shù)據(jù)庫中色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、丙酮酸代謝、組氨酸代謝、嘧啶代謝等相關(guān)通路信息,構(gòu)建腎陽虛水腫模型大鼠體內(nèi)受干擾的代謝網(wǎng)絡,見圖4,可知受干擾的苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、嘧啶代謝、組氨酸代謝之間通過丙酮酸代謝相互關(guān)聯(lián),且這些代謝紊亂與腎陽虛水腫證的病理變化密切相關(guān)。

3.5.1 苯丙氨酸代謝紊亂與腎臟毒素蓄積 圖3 ～4 顯示,腎陽虛水腫模型大鼠尿液中乙醛、苯乙酸水平上調(diào),苯乙酰甘氨酸、硫酸對甲酚水平下調(diào),表明大鼠體內(nèi)有苯丙氨酸代謝紊亂；大鼠尿液中硫酸對甲酚、硫酸吲哚酚水平下調(diào),表明兩者在大鼠體內(nèi)存在蓄積。硫酸對甲酚和硫酸吲哚酚均為氨基酸的腸道微生物代謝產(chǎn)物,并具有腎臟毒性,可引起腎臟損傷,加重腎臟功能不全［4,11］,可知大鼠體內(nèi)苯丙氨酸代謝紊亂與其腎臟毒素蓄積、腎功能損傷、水腫發(fā)生密切相關(guān)。

圖4 腎陽虛水腫模型受干擾代謝網(wǎng)絡Fig.4 Disturbed metabolic network of edema model of Kidney Yang Deficiency

3.5.2 色氨酸代謝紊亂 色氨酸代謝在行為、情緒、生長、免疫應答的調(diào)節(jié)過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］,其主要途徑為犬尿氨酸途徑和5-羥色胺途徑［4］。圖4 顯示,腎陽虛水腫模型大鼠體內(nèi)色氨酸代謝異常主要集中在5-羥色胺途徑,其2 個下游代謝物5-羥基吲哚乙醛和5-羥基犬尿胺在尿液中的水平均下調(diào),表明其水平呈上調(diào)變化。5-羥色胺可參與調(diào)節(jié)行為、睡眠、飲食、體溫等多種生理及代謝機能［13］,當其水平較高時容易出現(xiàn)反射亢進、發(fā)汗、 惡寒、 振顫、 腹瀉、 協(xié)調(diào)運動障礙等癥狀［14］,由此推測,大鼠出現(xiàn)的一系列耗竭現(xiàn)象(如活動減少、體重下降、蜷縮、拱背、畏寒、腹瀉等) 可能與其水平上調(diào)有密切關(guān)聯(lián)。

3.5.3 組氨酸、精氨酸和嘧啶代謝紊亂 圖4 顯示,腎陽虛水腫模型大鼠體內(nèi)顯著受到干擾的代謝通路還有組氨酸代謝、精氨酸代謝、 嘧啶代謝,三者均與機體的免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)［4,15］,故其發(fā)生紊亂時勢必引發(fā)腎陽虛水腫模型大鼠免疫機能下降。

3.6 腎陽虛、陰虛水腫模型比較 課題組前期已經(jīng)通過“阿霉素+甲狀腺片” 復合造模法建立腎陰虛水腫模型,并進行相關(guān)代謝組學研究,得到腎陰虛水腫模型的代謝輪廓特征、相關(guān)生物標志物、受干擾的代謝通路和代謝網(wǎng)絡［4］。表4 顯示,苯乙酰甘氨酸、硫酸對甲酚、乙醛、苯乙酸、硫酸吲哚酚、α-酮戊二酸、肌酐在2 種模型中的變化趨勢相同,主要代謝通路為與腎臟功能損傷、水腫發(fā)生密切相關(guān)的苯丙氨酸代謝；4,6-二羥基喹啉、3-甲基二氧化吲哚、5-羥基吲哚乙醛、5 羥基犬尿胺、尿嘧啶、尿苷、乳清酸、3-脲基丙酸、1-甲基組胺、咪唑乙酸在2 種模型中的變化趨勢相反,主要代謝通路為與腎陰虛、陽虛證密切相關(guān)的色氨酸代謝,以及與免疫功能紊亂密切相關(guān)的組氨酸代謝和嘧啶代謝。

表4 腎陰虛、陽虛水腫模型共有生物標志物Tab.4 Shared biomarkers for edema models of Kidney Yin Deficiency and Kidney Yang Deficiency

4 結(jié)論

腎陽虛水腫模型大鼠體內(nèi)苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、組氨酸代謝、精氨酸代謝、嘧啶代謝等多條通路受到明顯干擾,與大鼠腎臟功能損傷、水腫發(fā)生、耗竭癥狀、免疫功能紊亂均密切相關(guān)。腎陰虛、陽虛水腫模型中存在的腎臟功能損傷、水腫情況與2 種模型中類似的苯丙氨酸代謝紊亂有關(guān)；兩者之間迥異的動物狀態(tài)(腎陰虛動物之躁動、易驚、進食減少,腎陽虛動物之耗竭) 和免疫功能紊亂情況則主要與模型中波動趨勢相反的色氨酸、嘧啶、組氨酸代謝紊亂有關(guān),初步確定4,6-二羥基喹啉、3-甲基二氧化吲哚、5-羥基吲哚乙醛、5-羥基犬尿胺、尿嘧啶、尿苷、乳清酸、3-脲基丙酸、1-甲基組胺、咪唑乙酸等10 種代謝物可作為區(qū)分腎陰虛、陽虛證的潛在生物標志物。然而,本研究結(jié)果僅是基于腎陰虛、陽虛水腫模型的比較而初步得出,還有待于后期補充完善。