王新立, 劉汝銀, 王西彬, 岳宗進(jìn)

(河南省中醫(yī)院,河南 鄭州450000)

椎間盤突出以頸肩腰腿痛為主要臨床癥狀,其重要原因是椎間盤的退行性變化［1］,最關(guān)鍵的變化是髓核細(xì)胞減少,從而髓核基質(zhì)中主要成分含有量降低［2］。因此,促進(jìn)髓核細(xì)胞生長活力和增殖能力對(duì)防治椎間盤退變具有重要意義。

芍藥苷是芍藥主要有效成分,具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、影響細(xì)胞增殖的作用［3-4］,可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖,并能抑制髓核細(xì)胞凋亡［5］,但對(duì)其增殖作用尚不明確。文獻(xiàn)［6-7］ 報(bào)道,芍藥苷可抑制大腦中c-fos 表達(dá),并且后者具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞p27表達(dá)的作用,p27(p27kip1) 是細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子(CDKI) 家族成員之一,可調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、增殖［8］。因此,本實(shí)驗(yàn)探討芍藥苷對(duì)髓核細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料

胎牛血清和DMEM/F12 購自美國HyClone 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、XhoI、EcoRI、Turbofect 購自美國賽默飛世爾科技公司；BCA 試劑盒購自美國Pierce 公司；pcDNA3.1、SYBR Green I Prmix 購自大連寶生物工程有限公司；BrdU ELISA 試劑盒購自上海麥約爾公司；c-fos、p27、Ⅱ型膠原、Aggrecan、GAPDH 兔抗購自美國CST 公司；山羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；MTT購自生工生物工程(上海) 股份有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞分離培養(yǎng) 1%戊巴比妥鈉麻醉7 周齡雄性SD 大鼠(體質(zhì)量220～250 g),無菌條件下切除全部脊柱,收集大鼠腰椎間盤,切開外層纖維環(huán),將膠凍狀髓核完整取出,磷酸鹽緩沖液沖洗3 次,將分離組織用膠原蛋白酶處理3 h 后,DMEM/F12(含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素) 于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)1 周,細(xì)胞貼壁生長,倒置相差顯微鏡下用細(xì)胞刮刀刮除長梭形纖維細(xì)胞,待圓形或短梭形髓核細(xì)胞長成單一克隆體時(shí),0.25%胰酶消化且接種于新培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)90%融合后傳代,用第三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞Ⅱ型膠原、Aggrecan 免疫組織化學(xué)染色鑒定 第3 代髓核細(xì)胞爬片,室溫下多聚甲醛固定,40 min 后0.3%TritonX-100 孵育25 min, 含3%H2O2的甲醇室溫下作用20 min 后滴加山羊血清,室溫下反應(yīng)25 min。去除血清,分別滴加Ⅱ型膠原多抗(1 ∶80) 和Aggrecan 單抗(1 ∶200),濕盒4 ℃下過夜,PBS 洗凈滴加辣根過氧物酶標(biāo)記的二抗,室溫下孵育25 min,PBS 沖洗,DAB 顯色10 min 后用PBS 沖洗,蘇木精復(fù)染,沖洗,脫水封片。顯微鏡下隨機(jī)檢測(cè)10 個(gè)視野(×200),每個(gè)視野檢測(cè)20 個(gè)細(xì)胞,總共200 個(gè),分別計(jì)數(shù)Ⅱ型膠原和Aggrecan 免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算該細(xì)胞百分比,即髓核細(xì)胞純度。

2.3 細(xì)胞生長活力測(cè)定 將髓核細(xì)胞(1×105/孔)接種于96 孔板,不同濃度(0、0.5、1、2、5、8、10、15、 20、 25 μmol/L) 芍 藥 苷 處 理, 于5%CO2,37 ℃下培養(yǎng)24 h 后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL) 培養(yǎng)5 h。 去掉培養(yǎng)基, 每孔加入150 μL二甲基亞砜,溶解藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚,酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處光密度,重復(fù)3 次,取平均值。

2.4 BrdU 檢測(cè) 通過BrdU ELISA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,按照說明書進(jìn)行操作,酶標(biāo)儀檢測(cè)370 nm 處光密度以反映細(xì)胞增殖變化。每組3 個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3 次,取平均值。

2.5 qRT-PCR 檢測(cè) Trizol 試劑裂解細(xì)胞提取總RNA 并作為模板,反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng),GAPDH 為內(nèi)參,反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃5 min,94 ℃20 s,58 ℃ (c-fos) 或60 ℃(p27)25 s,共40 個(gè)循環(huán),延伸72 ℃10 min。反應(yīng)體系20 μL,含10 μL SYBR Premix Ex Taq II,cfos 正向5′-GTGGTGGAAGGCGTATCGAGTTT-3′,反向5′-GTGTGATGCCAGAAGCAGATCCA-3′； p27 正向5′-ATCCGTCGGACAGCCAGAC-3′,反 向5′-CACAGAACCGGCATTTGGG-3′。2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量,重復(fù)3 次,取平均值。

2.6 Western blot 檢測(cè) 裂解細(xì)胞收集總蛋白,BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將25 μg 蛋白加到聚丙烯酰胺凝膠電泳中進(jìn)行電泳,將凝膠上蛋白通過點(diǎn)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉溶液室溫封閉膜2 h,加入c-fos 兔單抗(1 ∶500)、p27兔單抗(1 ∶500)、GAPDH 兔單抗(1 ∶1 000),4 ℃下孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1 ∶1 000) 室溫下孵育2.5 h,洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔的二抗,室溫下孵育1 h,暗室曝光觀察結(jié)果。GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照蛋白,重復(fù)3 次,取平均值。

2.7 重組載體構(gòu)建 Trizol 法提取細(xì)胞總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以其為模板,利用PCR 方法擴(kuò)增c-fos (GenBank accession no：XM＿ 234422)全長且具有Xho 和EcoRI 酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件為94 ℃6 min,94 ℃25 s,56 ℃50 s,72 ℃1 min,共35 個(gè)循環(huán),72 ℃10 min。XhoI 和EcoRI 雙酶切c-fos 全長DNA 和pcDNA.3.1 質(zhì)粒,并且將產(chǎn)物連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中,挑選陽性克隆37 ℃增殖重組質(zhì)粒,提取質(zhì)粒,測(cè)序,將正確的重組質(zhì)粒命名為pcDNA.3.1-c-fos。

2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將髓核細(xì)胞接種于6 孔板中,37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h,參照Turbofect 操作說明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,將pcDNA.3.1-c-fos(6 μg)、pcDNA.3.1 (6 μg)、 p27 siRNA (5′-GCCAGCGCAAGUGGAAUUUCGAUUU-3′,6 μg)、 non-specific siRNA(6 μg) 分別與6 μL Turbofect 混合后加入各孔中,5%CO2條件下轉(zhuǎn)染24 h。 然后, 通過qRT-PCR、Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以表示,2 組間比較采用t 檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 髓核細(xì)胞鑒定 圖1 顯示,細(xì)胞中呈現(xiàn)大量陽性表達(dá),胞漿染成棕黃色,符合髓核特征,Ⅱ型膠原、Aggrecan 的免疫組化染色陽性細(xì)胞比例分別為97%、96%。

圖1 Ⅱ型膠原和Aggrecan 免疫組化染色（×100）Fig.1 Immunohistochemistry staining of type II collagen and Aggrecan（×100）

3.2 芍藥苷對(duì)髓核細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 圖2 顯示,芍藥苷終濃度8 μmol/L 時(shí),細(xì)胞活力和增殖顯著上調(diào)(P ＜0.05,P ＜0.01),但在25 μmol/L時(shí)兩者反而有所下降。

圖2 不同濃度芍藥苷對(duì)細(xì)胞活力和增殖的影響Fig.2 Effects of different concentrations of paeoniflorin on cell viability and proliferation

3.3 芍藥苷對(duì)c-fos 和p27 表達(dá)的抑制作用 圖3顯示,8 μmol/L 芍藥苷作用于細(xì)胞24 h 后,c-fos、p27 mRNA、蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.05,P＜0.01)。

圖3 芍藥苷對(duì)c-fos、p27 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of paeoniflorin on c-fos and p27 expressions

3.4 芍藥苷對(duì)p27 表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 圖4 顯示,與pcDNA.3.1 組比較,pcDNA.3.1-c-fos 組c-fos mRNA、蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01),表明c-fos過表達(dá)成功,同時(shí)p27 mRNA、蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)(P＜0.01)。另外,8 μmol/L 芍藥苷處理c-fos過表達(dá)細(xì)胞24 h 后,可顯著抑制芍藥苷對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

3.5 芍藥苷對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 圖5 顯示,與c-fos-non spe 組比較,p27 mRNA、蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。同時(shí),8 μmol/L 芍藥苷孵育c-fos 過表達(dá)和抑制p27 的髓核細(xì)胞24 h 后,細(xì)胞增殖顯著高于c-fos-non spe 組(P＜0.01)。

4 討論

椎間盤突出發(fā)生率呈上升趨勢(shì),退變后椎間盤髓核細(xì)胞數(shù)量減少,其分泌的Aggrecan 和Ⅱ型膠原也隨之降低,導(dǎo)致椎間盤功能減弱,從而發(fā)生形態(tài)學(xué)變化,引發(fā)腰腿痛。臨床上手術(shù)治療只能緩解病痛,無法從根本上根治椎間盤退變［9-10］。

芍藥苷是從芍藥干燥根中提取出的有效成分,具有抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用［11-16］,也可促進(jìn)椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞增殖［17］,促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由G0/G1 期進(jìn)入S 期來促進(jìn)其增殖［18］,但目前還沒有關(guān)于其對(duì)髓核細(xì)胞增殖影響的研究。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)大鼠腰椎間盤髓核細(xì)胞,以不同濃度芍藥苷處理24 h,發(fā)現(xiàn)該成分終濃度在8～20 μmol/L 時(shí),細(xì)胞活力和增殖均顯著上調(diào),呈現(xiàn)劑量依賴性,但在25 μmol/L 時(shí)反而有所下降,故以8 μmol/L 芍藥苷處理24 h 的髓核細(xì)胞為模型進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 c-fos 過表達(dá)對(duì)p27 表達(dá)、細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of c-fos overexpression on p27 expression and cell proliferation

圖5 c-fos 過表達(dá)和p27 敲低對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of c-fos overexpression and p27 knockdown on cell proliferation

文獻(xiàn)［6］ 報(bào)道,芍藥苷可抑制大腦中c-fos表達(dá),該基因是即刻早期基因,調(diào)控多種細(xì)胞增殖能力,Long 等［19］發(fā)現(xiàn)MicroRNA-101 通過抑制c-fos來抑制膀胱癌細(xì)胞和骨肉瘤的增殖和侵襲；該基因表達(dá)量下調(diào)可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖［20］；然而Mikula 等［21］研究表明其過表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖能力,可見它對(duì)不同細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用有所差異；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),8 μmol/L 芍藥苷處理24 h后髓核細(xì)胞c-fos 表達(dá)明顯降低,而且c-fos 過表達(dá)可明顯抑制髓核細(xì)胞增殖能力。研究表明,c-fos具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞p27 表達(dá)的作用［7］,它通過多種方式參與細(xì)胞周期調(diào)控,抑制細(xì)胞分裂和增殖,如乳腺癌細(xì)胞、Neuro-2a 細(xì)胞、胃癌細(xì)胞等［22-23］,Qiu 等［24］發(fā)現(xiàn)其表達(dá)降低可有效促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),8 μmol/L 芍藥苷處理髓核細(xì)胞24 h 后,p27 表達(dá)顯著降低,而且c-fos 過表達(dá)可有效抑制芍藥苷對(duì)其表達(dá)的下調(diào)作用。另外,在c-fos 過表達(dá)和芍藥苷處理的髓核細(xì)胞中減弱p27表達(dá)時(shí),可顯著促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖,表明芍藥苷通過調(diào)節(jié)c-fos 表達(dá)量來調(diào)控p27 表達(dá),進(jìn)而調(diào)控髓核細(xì)胞的增殖能力。

綜上所述,芍藥苷可促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖,呈現(xiàn)劑量依賴性,而且能抑制c-fos、p27 表達(dá),并通過c-fos 調(diào)控p27,進(jìn)而促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖。