張變?nèi)A　靳東升　郜春花　郜雅靜　李建華

摘要：以山西古交屯蘭工礦復(fù)墾區(qū)為研究對象，從不同植物種植、不同耕作制度的視角出發(fā)，將傳統(tǒng)分析與現(xiàn)代技術(shù)分析相結(jié)合，分析比較工礦復(fù)墾區(qū)植物根際微生物的多樣性，旨在為提高工礦區(qū)復(fù)墾的土壤質(zhì)量提供理論依據(jù)。傳統(tǒng)分析結(jié)果表明，豆科植物根際微生物細菌與放線菌的數(shù)量要高于禾本科植物，毛苕子根際細菌、放線菌數(shù)量與Shannon多樣性指數(shù)均高于其他植物，在大豆—玉米—玉米輪作制度下，大豆根際細菌、放線菌數(shù)量與Shannon多樣性指數(shù)高于玉米—大豆—大豆輪作制度下玉米根際的相應(yīng)指標(biāo)。用16S rDNA V3～V4區(qū)操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTU）進行不同植物根際細菌α多樣性分析，發(fā)現(xiàn)自然恢復(fù)土壤的Chao1豐富度高于種植植物的土壤，與種植植物根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)截然不同，連種毛苕子根際與玉米—大豆—大豆輪作制度下的玉米根際土壤具有豐度較低的相似性微生物屬，大豆與苜蓿的根際微生物具有相似的親緣性。

關(guān)鍵詞：工礦復(fù)墾區(qū);植物根際;微生物多樣性;Shannon多樣性指數(shù)

中圖分類號： S154.3? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0223-04

土壤微生物是維持土壤活性的重要組成部分，參與有機質(zhì)分解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)等多種生化過程，其多樣性是評價土壤環(huán)境質(zhì)量的重要生物學(xué)指標(biāo)[1]。礦區(qū)復(fù)墾土壤具有有機質(zhì)含量低、團聚體少、微生物活性差的特點，然而提高礦區(qū)復(fù)墾土壤質(zhì)量可以緩解我國人均耕地少、質(zhì)量差的現(xiàn)狀，并保持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。根際是連接植物、土壤和微生物的紐帶，植物根系通過分泌物、脫落物與植物殘體等影響根際土壤微生物群落代謝與種群結(jié)構(gòu)，進而改變根際土壤環(huán)境[2]。了解不同植被類型根際土壤的理化及微生物學(xué)特性，可以直接或間接反映植被對土壤的改良作用及植被恢復(fù)的生態(tài)效果。當(dāng)前國內(nèi)外的相關(guān)研究主要集中在根際與非根際土壤理化性質(zhì)、土壤微生物多樣性、土壤酶活性等方面[3-5]，目前僅有少量學(xué)者在工礦區(qū)開展了不同植物根際的評價研究[6-11]，對于山西工礦復(fù)墾區(qū)不同植物根際生物學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究較少。因此，將山西省古交屯蘭礦區(qū)復(fù)墾地作為試驗區(qū)，研究在種植不同植物的條件下根際土壤微生物多樣性特點具有重要意義，可以為土壤質(zhì)量改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗區(qū)位于山西省古交屯蘭工礦復(fù)墾區(qū)，于2014年開始復(fù)墾，試驗時為復(fù)墾第4年，該區(qū)年均氣溫為9.5 ℃，平均降水量為460 mm，為溫帶大陸性氣候，鄉(xiāng)土作物為玉米、大豆。本試驗設(shè)置5個小區(qū)，分別為大豆—玉米—玉米輪作區(qū)、玉米—大豆—大豆輪作區(qū)、連作苜蓿區(qū)、連作毛苕子區(qū)、自然恢復(fù)區(qū)。2017年，在大豆—玉米—玉米輪作區(qū)種植大豆，在玉米—大豆—大豆輪作區(qū)種植玉米。

1.2 材料與方法

土樣采集。在2017年9月在各試驗區(qū)內(nèi)選擇大小差不多的大豆15株，玉米5株;對于種植苜蓿、毛苕子與自然恢復(fù)的小區(qū)，劃定1 m×1 m區(qū)域采集樣品，設(shè)3次重復(fù)。采用抖落法[12]抖掉大塊土壤，用毛刷輕輕地將根上0～5 mm的土壤刷下作為根際土，收集在無菌塑料袋中，再放入裝有冰袋的保溫箱內(nèi)，帶回實驗室立即進行化驗，不能進行及時化驗的放入 -80 ℃ 冰箱中保存。

試驗方法。（1）采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法測定土壤微生物數(shù)量，細菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌培養(yǎng)采用高氏改良培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)采用孟加拉紅培養(yǎng)基。微生物數(shù)量以單位質(zhì)量（g）干土中的菌落數(shù)表示。（2）稱取10 g根際土壤，放入滅菌的、裝有90 mL 0.85% NaCl的帶玻璃珠的三角瓶中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上于250 r/min充分振蕩30 min，連續(xù)2次進行10倍稀釋后，在Biolog生態(tài)微板的每個孔中加入150 μL土壤接種液，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用Biolog分析儀每隔24 h讀取各孔的吸光度，連續(xù)測定7 d。（3）16S rDNA高通量測序，由上海派森諾生物公司對植物根際進行微生物組DNA提取、目標(biāo)片段PCR擴增、產(chǎn)物回收純化、熒光定量等，用MiSeq測序儀測定不同植物根際微生物V3～V4區(qū)的操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTU）。

數(shù)據(jù)分析。用Excel、SPSS及R軟件進行方差分析與聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1 細菌培養(yǎng)結(jié)果 從圖1可以看出，豆科植物毛苕子、苜蓿、大豆的根際細菌數(shù)量要高于禾本科植物玉米的根際細菌數(shù)量，毛苕子根際土壤的細菌數(shù)量最多，根際土壤細菌數(shù)量排序為毛苕子>大豆>自然恢復(fù)>苜蓿>玉米。

2.1.2 放線菌培養(yǎng)結(jié)果 從圖2可以看出，豆科植物毛苕子、苜蓿、大豆的根際放線菌數(shù)量要高于禾本科植物玉米的根際放線菌數(shù)量，但是苜蓿、玉米、大豆與自然恢復(fù)的根際放線菌數(shù)量相差不大，根際放線菌數(shù)量排序為毛苕子>苜蓿>大 豆> 自然恢復(fù)>玉米。

2.1.3 真菌培養(yǎng)結(jié)果 從圖3可以看出，豆科植物苜蓿、大豆的根際真菌數(shù)量要高于禾本科植物玉米的根際真菌數(shù)量，也高于自然恢復(fù)的，連種毛苕子的根際真菌數(shù)量最少，各個條件下的真菌數(shù)量排序為大豆>苜蓿>自然恢復(fù)>玉米>毛苕子。

2.2 用Biolog生態(tài)微板分析微生物代謝功能的多樣性

2.2.1 不同植物根際微生物群落土壤微生物的平均顏色變化率（AWCD）的動態(tài)變化 AWCD表示微平板孔中顏色的平均變化率，用來描述土壤微生物的代謝活性，計算公式如下：AWCD值=[∑（C-R）]/95[13]。其中：C是所測95個反應(yīng)孔的吸光度，R是對照孔的吸光度。

從圖4可以看出，不同植物根際微生物群落的AWCD值隨著培養(yǎng)時間的增加均呈現(xiàn)增長的趨勢，土壤微生物群落利用碳源的能力逐漸增強。從接種到培養(yǎng)24 h，各處理樣品平均吸光度無明顯變化，微生物幾乎沒有代謝碳源。在培養(yǎng) 24 h 后的任何時間段，毛苕子的AWCD值最高，說明其碳源利用速率高，根際土壤微生物活性較高。在培養(yǎng)24～48 h內(nèi)，自然恢復(fù)（NR）的AWCD值要高于玉米、苜蓿，但是培養(yǎng)48 h后，其利用的碳源量雖然在逐漸增加，但是增長緩慢，在培養(yǎng)72 h后的任何時間段均低于種植其他植物的，且在培養(yǎng)72 h后的任何時間點，植物根際的AWCD值均表現(xiàn)為毛苕子>大豆>苜蓿>玉米>自然恢復(fù)。

2.2.2 不同植物根際微生物多樣性指數(shù)的差異 微生物多樣性指數(shù)表征整個生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物群落利用碳源類型的多少，即功能多樣性。表征土壤微生物代謝功能多樣性的指標(biāo)為土壤微生物香農(nóng)-維納指數(shù)H′、Shannon多樣性指數(shù)H、Mclntosh均一度指數(shù)U和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)D[14]，計算公式見表1。

本研究采用96 h的數(shù)據(jù)來分析計算土壤微生物多樣性指數(shù)，由表2可見，工礦區(qū)不同植物根際土壤微生物群落的優(yōu)勢度指數(shù)（D）均無顯著差異，毛苕子根際土壤微生物群落Shannon指數(shù)H與均一度指數(shù)U顯著高于其他植物（P<005），且根際土壤微生物群落香農(nóng)-維納指數(shù)H′也高于自然恢復(fù)與禾本科植物玉米。自然恢復(fù)的均一度指數(shù)與Shannon指數(shù)H最低，與玉米、苜蓿的香農(nóng)-維納指數(shù)H′均無顯著差異，但是顯著低于輪作大豆根際土壤微生物群落的香農(nóng)-維納指數(shù)H′（P<0.05），說明該礦區(qū)自然恢復(fù)的土壤微生物利用碳源的能力較差，代謝功能差，活性較低。而毛苕子根際土壤利用碳源的能力最強，活性最高。不同輪作制度下大豆與玉米相比大豆根際土壤活性較強，利用碳源能力高于玉米根際，在工礦復(fù)墾初期豆科與禾本科植物輪作與連作豆科植物對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不同。

2.2.3 16S rDNA根際細菌α多樣性分析 微生物群落α多樣性可以用多種指數(shù)來反映，本研究選用Chao1豐富度估計指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)。一般而言，Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。Shannon多樣性指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度。Shannon指數(shù)越高，表明群落的多樣性越高。從表3可以看出，自然恢復(fù)的根際土壤Chao1指數(shù)最大，輪作大豆根際土壤的Chao1指數(shù)最小，苜蓿根際土壤的Shannon指數(shù)最高，而輪作玉米根際土壤的Shannon指數(shù)最小。

根據(jù)樣本間的相似程度對豐度排名前50位的屬進行聚類并繪制熱圖，對高豐度和低豐度的分類單元加以區(qū)分，以顏色梯度反映樣本之間的群落組成相似度。從圖5可以看出，主要可以分為自然恢復(fù)與種植植物2類， 其中種植植物類可以分為2類，自然恢復(fù)根際土壤中豐度較高的微生物屬主要有Mycobacterium（分枝桿菌屬）、Cryobacterium（喜冷桿菌屬）、Caenimonas、Ramlibacter（沙壤土桿菌屬）、Gaiella（放線菌屬）、

Nitrobacter（硝化菌屬）、Nordella（諾德氏菌屬）。在輪作制度下，大豆與連種苜蓿相似的屬主要有Variibacter（變桿菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬）、Ohtaekwangia、Lentzea（倫茨氏菌屬）與Gaiella（放線菌屬），但是豐度均不高;在玉米—大豆—大豆輪作制度下，玉米與連種毛苕子根際細菌群落的相似屬主要有Pseudoncardia（諾卡式菌屬）、Microvirga（微枝形桿菌屬）、Aeromicrobium（氣微菌屬）與Nonomuraea（野野村菌屬），豐度也不高。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同方法的優(yōu)點及局限性

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分析法簡單、快速、易操作，適用于測定具有特殊生理功能的微生物，然而有許多微生物無法培養(yǎng)，難以測定[15-17];Biolog分析主要通過研究對單一碳源底物利用能力的不同來鑒定微生物群落結(jié)構(gòu)，有方便快速、靈敏度高、分辨率強等優(yōu)點[18]，可彌補其他方法無法獲得微生物群體活性信息的不足[19]，但是培養(yǎng)條件的改變可能會引起微生物對碳底物實際利用能力的改變，從而造成一定的誤差，同時目前標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中菌種資料不完善，一些種類不能被準(zhǔn)確鑒定，只能得到相似類群[20-21];16S rDNA高通量測序法主要通過提取微生物組總DNA并進行定量，擴增，純化，測序，從而鑒定微生物菌群結(jié)構(gòu)[22]，但是對于序列相同的不同細菌難以進行鑒定。

3.2 礦區(qū)不同植物根際微生物多樣性差異

植物影響土壤環(huán)境，有研究表明，不同植物根系分泌物的成分與含量不同，植物根際微生物的功能代謝有差異[23]，因此不同植物對土壤微生物群落的影響不同[24]。在本研究中，用傳統(tǒng)培養(yǎng)法得到的結(jié)果表明，該工礦復(fù)墾區(qū)不同植物根際微生物數(shù)量不同，豆科植物根際微生物細菌、放線菌數(shù)量要多于禾本科植物，這可能與豆科植物本身具有較強的固氮能力相關(guān)。Biolog技術(shù)分析表明，不同植物根際微生物利用碳源能力存在差異性，自然恢復(fù)可利用碳源的微生物活性最低，代謝功能最差，可能與復(fù)墾初期自然恢復(fù)土壤有機質(zhì)含量低有關(guān)，而毛苕子根際微生物活性最高。16S rDNA分析表明，自然恢復(fù)根際微生物與種植植物根際微生物差異大，且微生物豐度最高，但是多樣性指數(shù)低于豆科植物，高于禾本科植物。

3.3 將來的研究方向

本研究區(qū)處于工礦復(fù)墾初期，礦區(qū)生態(tài)環(huán)境恢復(fù)與耕地面積的增加是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵，在民生福祉的建設(shè)中意義重大，因此，需要多種方法與技術(shù)相結(jié)合并進行長期監(jiān)測以關(guān)注礦區(qū)土壤質(zhì)量的變化，為礦區(qū)生態(tài)建設(shè)提供理論依據(jù)。

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