楊瑩　劉冬雪　郭英　卜寧

摘要：為給牧草專用微生物肥的研制提供菌株材料，從蒙遼交界沙化土壤中分離出2株芽孢桿菌菌株STW-2、STW-64，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)和16S rDNA測序分析進(jìn)行鑒定，并對其進(jìn)行抗旱解磷能力研究。結(jié)果表明，菌株STW-2為阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai），STW-64為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）;STW-64菌株抗旱能力明顯高于STW-2菌株;STW-2菌株在培養(yǎng)前3 d解無機(jī)磷的能力高于STW-64菌株，最高解磷率可達(dá)9.66%，但隨著培養(yǎng)時間的增加，STW-64菌株解無機(jī)磷能力逐漸高于STW-2菌株，培養(yǎng)至7 d時其解磷率可達(dá)117%，STW-2菌株在干旱脅迫下解無機(jī)磷的能力明顯高于STW-64菌株;STW-2菌株在培養(yǎng)4 d時解有機(jī)磷效果最好，其解磷率為2.48%，STW-64菌株在干旱脅迫下解有機(jī)磷能力整體高于STW-2菌株。2株芽孢桿菌在抗旱解磷方面均表現(xiàn)出不同的作用效果，在改善沙化土壤磷有效性和制備牧草專用生物肥料方面具有一定的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌;分離鑒定;抗旱;解磷

中圖分類號： S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0260-04

蒙遼交界的阜新市彰武縣章古臺鎮(zhèn)位于122°22′E、42°43′N，地處科爾沁沙地東南端，年降水量450～550 mm，為細(xì)沙質(zhì)荒漠化土地[1]。這種沙化土壤物理黏粒少，沙粒間隙大，保水性差，腐植質(zhì)含量極低，氮、磷缺乏，土表溫度升高和降低的速度快，一般不能為植物所利用[2]。磷是植物生長的必需元素之一，植物缺乏磷元素，多種代謝活動受到抑制，植株生長緩慢。土壤中磷素主要以無機(jī)磷和有機(jī)磷2種形式存在，無機(jī)磷主要以磷酸三鈣、磷酸鋁、磷酸鐵3種化合物的形式存在[3]，在施撒的肥料中70%以上水溶性磷與土壤中的Ca2+、Al3+等結(jié)合形成不同形式的磷[4]，其中難溶性磷酸鹽約占土壤磷酸鹽總量的95%～99%[5]，不能直接被植物吸收和利用，幾乎為無效態(tài)磷。土壤結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致磷元素流失，使水體富營養(yǎng)化，污染環(huán)境[6]。解磷菌是能夠溶解土壤中的難溶性磷并可將其轉(zhuǎn)化成植物可以利用的可溶性磷的有益微生物菌群[7]，能提高土壤可利用態(tài)磷含量。本研究從沙化土壤中分離篩選具有抗旱解磷能力的菌株，探究其抗旱解磷功能，以期為沙化土壤的牧草專用菌肥研制提供良好的菌種資源，為改善營養(yǎng)貧瘠的沙化土壤、解決破碎化草地復(fù)壯問題提供一定的理論支持和實(shí)踐應(yīng)用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 于2016年10月在蒙遼交界阜新市彰武縣章古臺鎮(zhèn)的遼寧省風(fēng)沙土壤研究所內(nèi)的4個采樣點(diǎn)采集沙化土樣，分別標(biāo)記為SH1、SH2、SH3、SH4，將樣品立即帶回實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0～7.2。

無機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、硫酸銨0.5 g、氯化鈉0.3 g、氯化鉀0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·7H2O 0.03 g、Ca3（PO4）2 5 g、瓊脂20 g、蒸餾水 1 000 mL、pH值7.0～7.5[8]。

有機(jī)磷卵黃培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g、牛肉膏5.0 g、蛋白胨 10.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0～7.5，臨用時每50 mL溶液中加入新鮮蛋黃液3 mL（蛋黃液按無菌生理鹽水與雞蛋黃體積比為1 ∶ 1配制）。

1.1.3 藥品 聚乙二醇6000（PEG6000）：將訂購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司的PEG6000配制為0、30、60、90、120、150、180、210 g/L的不同濃度梯度，干旱脅迫分為輕度脅迫（<10%）、中度脅迫（10%～20%）、重度脅迫（>20%）3個等級。

1.2 方法

1.2.1 沙化土壤微生物的分離篩選

1.2.1.1 沙化土壤微生物的分離純化 稱取4種土樣各 10 g 分別放入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，置于120 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)0.5 h，分別得到土壤懸液1、懸液2、懸液3、懸液4。將各土壤懸液分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4 g/mL。取已稀釋的土壤懸液分別涂布于平板培養(yǎng)基上，25 ℃，培養(yǎng)3 d。采用連續(xù)劃線法對菌株進(jìn)行純化，即挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，最后將已純化的菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，于4 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 微生物菌株的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)觀察。將已分離純化的菌株涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落;單染色制片，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞個體形態(tài)。（2）生理生化鑒定。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版方法進(jìn)行糖發(fā)酵、淀粉水解反應(yīng)、明膠液化、檸檬酸鹽試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V-P）、H2S試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原反應(yīng)等生理生化指標(biāo)。（3）分子生物學(xué)鑒定。提取細(xì)菌基因組DNA，利用27F、1492r正反引物進(jìn)行16S rDNA序列PCR擴(kuò)增，將測得的16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 2芽孢桿菌抗旱能力測定 母液制備：將2株芽孢桿菌分別接入牛肉膏液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h;將母液以5%的接種量接入含不同濃度的PEG液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)2 d，于紫外分光光度計(jì)下測定D700 nm值，分析其抗旱能力。

1.2.3 2株芽孢桿菌解磷能力測定

1.2.3.1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取經(jīng)105 ℃烘干2 h的磷酸氫二鉀0.439 0 g，用水溶解后，加入5 mL濃硫酸，然后加水定容至1 000 mL，該溶液含磷100 mg/L，將該溶液稀釋為5 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取 5 mg/L 磷標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10 mL于50 mL容量瓶中，同時加入與顯色測定所用的樣品溶液等體積的空白溶液及二硝基酚指示劑2～3滴，并用10%碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)溶液至剛呈微黃色，準(zhǔn)確加入鉬銻抗顯色劑5 mL，搖勻，加水定容，即得含磷量分別為0、0.2、04、0.6、0.8 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，于25 ℃放置30 min后，在波長為700 nm處，測定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，磷濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]。

1.2.3.2 菌株發(fā)酵培養(yǎng) 將篩選出的菌株接入盛有牛肉膏液體培養(yǎng)基的搖瓶中，在28 ℃ 120 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng) 48 h，獲得發(fā)酵液。

1.2.3.3 解無機(jī)磷能力測定 將發(fā)酵液以2%的接種量接入無機(jī)磷培養(yǎng)基中，裝液量為30 mL/150 mL，對照組中接入同等體積的無菌水，每組4個平行，于28 ℃、120 r/min分別振蕩培養(yǎng)1、2、3、5、7 d，然后采用鉬銻抗比色法測定解磷含量[4]，并計(jì)算解磷率。

干旱脅迫下解無機(jī)磷的測定方法：將發(fā)酵液以相同方法接入含有濃度為150 g/L的PEG無機(jī)磷培養(yǎng)基中，以上述相同的方法對解磷含量進(jìn)行測定，并計(jì)算解磷率。

解磷率=（培養(yǎng)后接菌培養(yǎng)液中PO43-含量-對照培養(yǎng)液中PO43-含量）/培養(yǎng)前未接菌培養(yǎng)液中PO43-含 量×100%[5]。

1.2.3.4 解有機(jī)磷能力測定 用無菌濾紙片蘸取10 μL菌株發(fā)酵液接種于有機(jī)磷卵黃平板培養(yǎng)基中心位置，每株菌設(shè)3個平行，對照組蘸取等量無菌水用同樣方法接種，于28 ℃條件下，分別培養(yǎng)1、2、3、5、7 d，測定解磷圈直徑D和菌落生長直徑d，解磷率=D/d×100%。

干旱脅迫下解有機(jī)磷的測定方法：以上述相同方法將菌株發(fā)酵液接種于濃度為60 g/L的PEG有機(jī)磷卵黃平板中，于28 ℃條件下，分別培養(yǎng)1、2、3、5、7 d，測定解磷圈直徑D和菌落生長直徑d，解磷率=D/d×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙化土壤微生物的分離鑒定

從沙化土壤中分離得到76株細(xì)菌，將其中2株分別命名為STW-64、STW-2。

2.2 2株芽孢桿菌菌株的鑒定

2.2.1 2株細(xì)菌的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定 分別對菌落和菌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STW-2菌落呈圓形，表面濕潤光滑，菌落微黏，淡黃色，不透明;菌體革蘭氏染色陽性，能運(yùn)動，可產(chǎn)生內(nèi)生孢子，桿狀，長度約2 μm，直徑約1 μm（圖1）。STW-64菌落呈圓形，表面光滑，濕潤，乳白色，不透明;菌體桿狀，末端圓，單個或呈短鏈排列，1.2～1.5×2.0～4.0 μm，能運(yùn)動，革蘭氏染色呈陽性，具內(nèi)生孢子（圖2）。

分別對2株細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果見表1。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果，確定STW-2、STW-64均為芽孢桿菌屬，其中 STW-2 菌株是阿氏芽孢桿菌，STW-64菌株是巨大芽孢桿菌。

2.2.2 16S rDNA分子鑒定結(jié)果 菌株16S rDNA序列擴(kuò)增和序列分析比對結(jié)果見表2，NCBI 數(shù)據(jù)庫中與菌株相似度較高的菌株均屬于Bacillus，屬其中模式種Bacillus aryabhattai、Bacillus megaterium與菌株STW-2、STW-64的基因同源性相似度分別達(dá)到99%、100%（圖3）。

形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，STW-2菌株為阿氏芽孢桿菌，STW-64菌株為巨大芽孢桿菌。

2.3 2株芽孢桿菌菌株抗旱能力

從圖4可以看出，2株芽孢桿菌菌株在干旱脅迫條件下，菌株懸液的吸光度隨著PEG濃度的增加整體呈下降趨勢，說明干旱脅迫對菌株生長有影響。隨著PEG濃度的增加，菌體數(shù)量逐漸下降，至PEG濃度為210 g/L（重度脅迫）時，其2株菌株仍有一定的存活，表明其抗旱能力很強(qiáng)。

2.4 2株芽孢桿菌菌株解磷能力

2.4.1 2株芽孢桿菌降解無機(jī)磷能力 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

2.4.1.1 無脅迫條件下解無機(jī)磷能力 從圖6可以看出，在以磷酸三鈣為唯一磷源的培養(yǎng)基中，2株菌均有不同程度降解無機(jī)磷的能力，隨著培養(yǎng)時間的增加，解磷含量也不斷增加，通過鉬藍(lán)比色法測定得到，STW-2菌株在培養(yǎng)2 d時的解磷率達(dá)到9.04%， STW-64菌株在培養(yǎng)7 d時的解磷率達(dá)11.61%。

2.4.1.2 干旱脅迫條件下菌株解無機(jī)磷能力 從圖7可以看出，2株菌在150 g/L PEG濃度脅迫下以磷酸三鈣為唯一磷源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，STW-2、STW-64菌株的解磷量均隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸升高，培養(yǎng)7 d時的解磷率分別達(dá) 5.03%、4.03%。

2.4.2 2株芽孢桿菌降解有機(jī)磷能力

2.4.2.1 無脅迫條件下降解有機(jī)磷能力 2株菌均有溶解有機(jī)磷能力，圖8為培養(yǎng)4 d后拍攝的解磷平板，可以看出，2株菌解磷圈大小不同，初步判定解磷能力不同。從圖9可以看出，STW-2菌株在培養(yǎng)4 d時達(dá)到最大解磷能力，解磷率值達(dá)到2.48%;STW-64菌株在培養(yǎng)1 d時解磷能力達(dá)到最大，對應(yīng)解磷率為1.80%，隨著時間的延長，2株菌的解磷能力逐漸下降，但STW-2菌株解磷能力高于STW-64菌株。

2.4.2.2 干旱脅迫條件下降解有機(jī)磷能力 干旱脅迫下2株菌溶解有機(jī)磷的能力均低于正常條件下，從圖10可以看出，STW-2菌株在干旱脅迫條件下培養(yǎng)2 d時解磷能力達(dá)到最大，解磷率達(dá)1.42%;STW-64菌株在干旱脅迫條件下培養(yǎng)1 d時解磷率達(dá)1.96%，隨著培養(yǎng)時間延長菌株解磷能力整體下降。但是干旱條件脅迫下STW-64菌株解磷能力整體高于STW-2菌株。

3 討論與結(jié)論

通過無機(jī)磷、有機(jī)磷平板復(fù)篩解磷菌可能會漏掉一些溶磷菌，本研究發(fā)現(xiàn)，在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基中幾乎沒有溶解無機(jī)磷能力的菌（數(shù)據(jù)未展示），通過液體發(fā)酵培養(yǎng)會表現(xiàn)出不同程度的溶磷能力，通過固體和液體2種方式培養(yǎng)菌株進(jìn)一步研究其解磷能力更為合理。

本研究發(fā)現(xiàn)，解磷菌在干旱脅迫條件下解有機(jī)磷能力并不是隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增強(qiáng)，相反是在培養(yǎng)過程中某一天表現(xiàn)出較強(qiáng)的解磷能力，說明不能在培養(yǎng)特定時間時測定其解磷能力，這樣可能會造成誤差。

細(xì)菌解磷是一個漫長而又復(fù)雜的過程[9-10]，在解磷過程中，發(fā)酵液的pH值會變小，說明細(xì)菌在解磷過程中產(chǎn)生了酸性物質(zhì)。酸性物質(zhì)能與鈣、鐵、鎂等金屬形成絡(luò)合反應(yīng)，使磷酸鹽溶解[11]。

本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下篩選得到2株能夠溶解無機(jī)磷和有機(jī)磷的菌，但是實(shí)驗(yàn)室中模擬的干旱脅迫條件與自然環(huán)境的沙化土壤條件還存在很大差異，因此，這2株菌作為菌肥是否能夠在沙化土壤中發(fā)揮其重要作用，還有待在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)一步驗(yàn)證。

研究發(fā)現(xiàn)，2株菌有不同程度的解磷能力，無脅迫條件下，STW-64菌株在培養(yǎng)3 d的解無機(jī)磷能力較強(qiáng)，STW-2菌株解有機(jī)磷能力較強(qiáng)。STW-64菌株抗旱能力明顯高于STW-2菌株。STW-2菌株在干旱脅迫條件下解無機(jī)磷的能力明顯高于STW-64菌株，STW-64菌株在干旱脅迫條件下解有機(jī)磷能力整體高于STW-2菌株。

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