辛董董　朱自果　候行行　連艷會(huì)　 閆丹丹　 張洋　李桂榮

摘要：以粉紅亞都蜜、紅巴拉蒂、里扎巴特、新西蘭攀金等4種葡萄品種的花粉為試驗(yàn)材料，分別貯藏在-5、-10、-15、-20、-25、-30、-80 ℃溫度條件下，貯藏1、3、5 d，然后用200 g/L蔗糖+50 mg/L硼酸+ 8 g/L瓊脂固體培養(yǎng)基作為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，進(jìn)行花粉離體培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同溫度處理下貯藏5 d后，紅巴拉蒂在-10 ℃下花粉生活力最高;粉紅亞都蜜在 -80 ℃ 下花粉生活力最高;新西蘭攀金在-20 ℃下花粉生活力最高;里扎巴特在-20 ℃下花粉生活力最高;不同品種的葡萄花粉量不同，摩爾多瓦的花粉量最多，為11 833±780個(gè)。柱頭可授性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明，不同葡萄品種柱頭可授性強(qiáng)弱不同，摩爾多瓦的柱頭可授性最強(qiáng)，適合在雜交育種作母本。

關(guān)鍵詞：葡萄;花粉生活力;花粉量;柱頭可授性

中圖分類號(hào)： S663.101? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0113-04

近年來我國(guó)葡萄（Vitis vinifera L.）的種植面積逐漸擴(kuò)大。在現(xiàn)代技術(shù)的引領(lǐng)之下，避雨棚、溫室等先進(jìn)的栽培設(shè)施與配套的栽培技術(shù)相繼出現(xiàn)，加快了我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。先進(jìn)的栽培設(shè)施雖然使我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，但由于這類栽培設(shè)施都存在一個(gè)致命的缺陷——濕度過大，長(zhǎng)期生長(zhǎng)在這種高溫高濕、光照不足的人造小氣候環(huán)境內(nèi)的葡萄，其抗性必然下降，培育出抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良葡萄品種，是今后葡萄育種的發(fā)展趨勢(shì)。在葡萄育種中最為重要的育種手段就是雜交育種[2-3]。雜交育種中，父母本的選擇是育種最重要的保證。花粉活力是評(píng)估花粉細(xì)胞活性的依據(jù)之一，高生活力的花粉、較多花粉量、較強(qiáng)柱頭可授性是雜交育種成功的一個(gè)重要前提，花粉生活力的高低、花粉量的多少、柱頭可授性強(qiáng)弱直接影響授粉、受精乃至坐果[4-8]。因此，在使用貯藏的葡萄花粉之前對(duì)其進(jìn)行生活力的測(cè)定是保證雜交授粉獲得較高坐果率的關(guān)鍵步驟[9]。本試驗(yàn)選取不同鮮食葡萄品種花粉，通過離體培養(yǎng)的方法，對(duì)不同溫度處理下的花粉生活力進(jìn)行研究，探索最佳花粉的貯藏方法，通過血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定不同鮮食葡萄品種花粉量，并采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測(cè)定葡萄品種柱頭可授性，探索柱頭可授性的強(qiáng)弱，旨在為葡萄育種中親和力強(qiáng)的父母本的選擇提供理論依據(jù)，有助于提高雜交授粉率，獲得較高的雜交后代率。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料于2017年5月5日取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹所葡萄資源圃，鮮食葡萄品種有粉紅亞都蜜、紅寶石無核、美人指、無核白雞心、玫瑰香、里扎巴特、維多利亞、新西蘭攀金、金手指、摩爾多瓦、紅巴拉蒂、弗蕾無核、黑色甜菜等，共計(jì)13個(gè)。

1.1.1 花粉采集 在葡萄初花期選擇紅巴拉蒂、粉紅亞都蜜、新西蘭攀金、里扎巴特等4個(gè)品種生長(zhǎng)健壯的植株，隨機(jī)取下發(fā)育正常的花序，分別裝入保鮮袋，再放入裝有冰袋的保溫箱內(nèi)帶回河南科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。除去花序頂部發(fā)育較差的花蕾后，取出花藥，放在墊有硫酸紙的培養(yǎng)皿中，及時(shí)剔除其中的雜質(zhì)和破裂的花藥，然后將培養(yǎng)皿放置在陰涼干燥處自然陰干，室溫條件下，經(jīng)一定時(shí)間后花粉開裂，待花粉完全散出干燥后倒入研缽中研磨，經(jīng)過花粉篩除去雜質(zhì)，收集備用。

1.1.2 花粉貯藏 將葡萄花粉分別裝入2 mL離心管中，封口膜密封管口，貼上標(biāo)簽。然后將裝有花粉的離心管分別放入裝有100 mL/L氯化鈣的干燥器中保存，在-5、-10、-15、-20、-25、-30、-80 ℃溫度條件下貯藏。各貯藏條件下的花粉分別間隔1、3、5 d進(jìn)行觀察。

1.2 方法

1.2.1 花粉生活力測(cè)定 采用離體萌發(fā)法測(cè)定花粉萌發(fā)率。將配置好的培養(yǎng)基（200 g/L蔗糖+50 mg/L硼酸+ 8 g/L瓊脂）倒入干凈的培養(yǎng)皿中，待其冷卻凝固后備用。利用牙簽蘸取貯藏在不同溫度下的不同葡萄品種花粉（每個(gè)溫度條件下的每個(gè)葡萄品種更換一個(gè)牙簽，防止交叉污染），然后輕輕抖動(dòng)牙簽將花粉均勻撒落到培養(yǎng)基上，標(biāo)記，放在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、2、3、5 h后進(jìn)行花粉萌發(fā)情況的觀察，一般以萌發(fā)后花粉管長(zhǎng)度超過花粉粒直徑的 1/2 來作為花粉粒萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)離體培養(yǎng)的花粉用倒置顯微鏡觀察3個(gè)區(qū)域，并記錄花粉粒的萌發(fā)數(shù)與總數(shù)，花粉萌發(fā)率=視野內(nèi)萌發(fā)的花粉粒數(shù)/視野內(nèi)花粉粒的總數(shù)×100%。

1.2.2 花粉量的測(cè)定 采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定花粉量。將初期葡萄花序帶回實(shí)驗(yàn)室并剝?nèi)ネ膺?～3輪小花花藥，每個(gè)品種取30枚花藥放入干凈的10 mL離心管中（貼標(biāo)簽），立即放入50 ℃烘箱中烘干?；ㄋ幫耆验_花粉散出后加入20%的六偏磷酸鈉溶液，定容至6 mL，然后振蕩搖勻成懸浮液，用移液槍吸取2 μL懸浮液滴在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上用普通顯微鏡（10×40倍）進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)花粉量，花粉量=（80小格內(nèi)的花粉數(shù)/80）×400×10 000×600，重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.2.3 柱頭可授性的測(cè)定 采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測(cè)定葡萄品種柱頭可授性。取無核白雞心、維多利亞、玫瑰香、弗蕾無核、摩爾多瓦、黑色甜菜、金手指、紅寶石無核、美人指等9個(gè)品種葡萄不同發(fā)育時(shí)期新鮮單花柱頭（含苞待放、半開放、完全開放）各30枚，完全浸泡在反應(yīng)液V（1%聯(lián)苯胺） ∶ V（3%過氧化氫） ∶ V（水）=4 ∶ 11 ∶ 22中，15 min后在T式顯微鏡下觀察，根據(jù)染色強(qiáng)弱和氣泡量劃分可授性能力強(qiáng)弱。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2003和DPS 9.50進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄品種花粉生活力的比較

研究發(fā)現(xiàn)，紅巴拉蒂花粉在-25 ℃的條件下進(jìn)行貯藏最適宜，且貯藏3 d效果最好，花粉生活力達(dá)到（16.80±1169）%（表1、圖1-A）;在-30 ℃的條件下貯藏1 d的生活力最高，達(dá)到（1124±4.75）%;在-20 ℃的條件下貯藏 3 d 的花粉生活力最高，達(dá)到（10.74±6.10）%;在-5、-10、-15、-80 ℃的條件下貯藏5 d后的花粉生活力最高，分別達(dá)到（16.54±4.65）%、（16.67±648）%、（16.63±6.69）%、（12.23±5.29）%;在-30 ℃的條件下貯藏5 d的生活力最低（表1、圖1-B）。因此，紅巴拉蒂適于在-25 ℃的條件下貯藏3 d。粉紅亞都蜜花粉在 -30 ℃ 的條件下貯藏1 d的生活力最高，達(dá)到（6.79±049）%;在-25 ℃的條件下貯藏3 d的生活力最高，達(dá)到（6.17±3.27）%;在-5、-10、-15、-20、-80 ℃的條件下貯藏5 d的生活力最高，分別達(dá)到（670±0.58）%、（6.58±1.63）%、（5.25±084）%、（5.09±1.81）%、（7.94±337）%;在-80 ℃的條件下貯藏1 d的生活力最低，因此，粉紅亞都蜜在-30 ℃的條件下貯藏1 d可以作為雜交育種的父本材料。新西蘭攀金花粉在-10、-15 ℃的條件下貯藏 1 d 的生活力最高，達(dá)到（7.44±0.29）%、（644±0.29）%;在 -80 ℃ 的條件下貯藏3 d的生活力最高，達(dá)到（8.48±285）%;在-20、-25 ℃的條件下貯藏5 d的生活力最高，分別達(dá)到（833±6.31）%、（7.23±3.96）%;在-80 ℃的條件下貯藏1 d的生活力最低。新西蘭攀金在 -80 ℃ 的條件下貯藏3 d效果最好，因此，新西蘭攀金在 -80 ℃ 的條件下貯藏3 d可以作為雜交育種的父本材料。里扎巴特花粉在-10 ℃的條件下貯藏1 d的生活力最高，達(dá)到（8.96±2.01）%;在-5、-80 ℃的條件下貯藏3 d的生活力最高，達(dá)到（12.03±7.32）%、（8.22±4.32）%;在-15 ℃、-20 ℃、-25 ℃、-30 ℃的條件下貯藏5 d的生活力最高，分別達(dá)到（8.45±0.41）%、（9.97±3.68）%、（8.52±2.37）%、（6.56±0.87）%;在-80 ℃的條件下貯藏1 d的生活力最低（表1）。里扎巴特在-5 ℃的條件下進(jìn)行貯藏最為適宜，且貯藏3 d效果最好，因此，里扎巴特在-5 ℃的條件下貯藏3 d可以作為雜交育種的父本材料。結(jié)果表明，紅巴拉蒂的生活力最強(qiáng)，新西蘭攀金次之，再次是里扎巴特，粉紅亞都蜜最弱。因此，在雜交育種中可以選擇紅巴拉蒂作為父本材料。

2.2 不同葡萄品種單花藥花粉量的比較

研究發(fā)現(xiàn)，不同葡萄品種單花藥花粉量不同，其中紅巴拉蒂的單花藥花粉量最多，為11 833±780個(gè);在0.05水平下，粉紅亞都蜜、新西蘭攀金、里扎巴特3種葡萄的單藥花粉量與紅巴拉蒂的單藥花粉量差異顯著，花粉量分別為（11 467±305）、（11 000±153）、（10 267±338）個(gè);在0.01水平下，粉紅亞都蜜、新西蘭攀金、里扎巴特3種葡萄的單藥花粉量與紅巴拉蒂的單藥花粉量均差異不顯著（表2）。

2.3 不同葡萄品種柱頭可授性的比較

研究發(fā)現(xiàn)，不同葡萄品種柱頭氣泡數(shù)不同，其中摩爾多瓦在已開放花期時(shí)的柱頭氣泡數(shù)最多，為29個(gè)， 說明此柱頭的過氧化物酶活性最強(qiáng)，柱頭可授性最強(qiáng)（表3）。紅寶石無核含苞待放、半開放花期時(shí)的柱頭氣泡數(shù)最少，為4個(gè)，說明此柱頭的過氧化物酶活性最弱，柱頭可授性最弱。弗蕾無核、黑色甜菜、紅寶石無核、美人指的3個(gè)花期的柱頭氣泡數(shù)目普遍偏少，平均分別為9、9、4、6個(gè)，說明這些葡萄品種的柱頭過氧化物酶活性較弱，柱頭可授性也比較弱。無核白雞心、維多利亞、玫瑰香、摩爾多瓦、金手指3個(gè)花期的柱頭氣泡數(shù)目普遍較多，平均分別為18、18、23、20、13，說明這些葡萄品種的柱頭過氧化物酶活性較強(qiáng)，柱頭可授性也比較強(qiáng)，其中，玫瑰香3個(gè)花期的氣泡數(shù)目的平均值最大，且在已開放花期的時(shí)候，柱頭經(jīng)過染色顏色最深、氣泡數(shù)目最多（圖2-A），紅寶石無核3個(gè)花期的氣泡數(shù)目的平均值最小，且在已開放花期的時(shí)候，柱頭經(jīng)過染色顏色比較淺、氣泡數(shù)目比較少（圖2-B）。因此，在雜交育種過程中，可以選擇已經(jīng)開放的摩爾多瓦葡萄品種作母本材料。

研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測(cè)不同葡萄品種柱頭的可授性， 其中維多利亞、摩爾多瓦、黑色甜菜、金手指、

美人指葡萄品種在含苞待放、半開放各花期的柱頭均表現(xiàn)有最強(qiáng)的可授性。無核白雞心半開放花期表現(xiàn)為最強(qiáng)的可授性，而已開放、含苞待放花期的柱頭均表現(xiàn)有較強(qiáng)的可授性。玫瑰香半開放、已開放花期的柱頭表現(xiàn)為最強(qiáng)的可授性，而含苞待放的柱頭均表現(xiàn)有較強(qiáng)的可授性（表4）。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)不同鮮食葡萄品種不同溫度處理下花粉生活力、花粉量測(cè)定以及柱頭可授性進(jìn)行了研究，為葡萄育種中父本花粉生活力的測(cè)定、花粉量測(cè)定、母本柱頭可授性測(cè)定及其選擇提供理論依據(jù)，有助于葡萄雜交育種獲得抗性強(qiáng)的父母本葡萄品種，父母本如果花期不同，可以將父本的花粉在適宜的條件下貯藏起來，以達(dá)到調(diào)節(jié)花期的目的，且保證貯藏后的花粉具有較強(qiáng)的生活力，才能確保后期雜交授粉的成功[10-12]。保證花粉生活力強(qiáng)弱的重要因素是要具有適當(dāng)?shù)馁A藏條件，比如在干燥、低溫的環(huán)境條件下，能夠較好地保持花粉的生活力，以供不同雜交組合和不同時(shí)期的雜交育種。不同葡萄品種花粉的生活力存在著較大的差異。選擇花粉生活力強(qiáng)的父本和配制良好的雜交組合，是保證雜交育種工作成功的重要依據(jù)[13-15]。

花粉的貯藏溫度和濕度是影響花粉貯藏時(shí)間長(zhǎng)短的主要因素[16]。在高溫、高濕的情況下，花粉酶的水解活性增強(qiáng)，代謝作用也加強(qiáng)，并且進(jìn)行著強(qiáng)烈的呼吸作用，消耗大量養(yǎng)分，且易被微生物感染發(fā)霉變質(zhì)而喪失萌發(fā)率。花粉貯藏過程中，保持較低的環(huán)境濕度，可以使其代謝受到抑制，酶活性減弱，呼吸作用降低，使花粉活力維持較長(zhǎng)時(shí)間，貯藏花粉的壽命往往與環(huán)境相對(duì)濕度呈負(fù)相關(guān)[17-18]。本試驗(yàn)研究表明，-25、-30 ℃貯藏條件下葡萄干燥花粉的貯藏效果最好，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉生活力逐漸降低，主要原因是花粉內(nèi)養(yǎng)分逐漸消耗，酶活性逐漸降低;在-5 ℃條件下花粉生活力下降最為迅速，主要原因是貯藏溫度較高，花粉內(nèi)酶活性較強(qiáng)，代謝作用加快，過度消耗花粉內(nèi)貯藏的養(yǎng)分;而-15、-20 ℃ 條件就處于二者之間，是短期貯藏最為理想便捷的貯藏方式。

柱頭可授性影響授粉成功率。不同植物柱頭可授期持續(xù)時(shí)間不等，花朵的開放期、柱頭分泌物的有無等對(duì)它都有影響[19-20]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)不同葡萄品種柱頭可授性強(qiáng)弱不同，其中維多利亞、摩爾多瓦、黑色甜菜、金手指、美人指葡萄品種的含苞待放、半開放、已開放3個(gè)花期的柱頭都表現(xiàn)為最強(qiáng)的可授性。紅寶石無核的未開、半開、已開3個(gè)花期的柱頭均表現(xiàn)有較強(qiáng)的可授性。無核白雞心半開表現(xiàn)為最強(qiáng)的可授性，而已開、未開花期的柱頭均表現(xiàn)有較強(qiáng)的可授性。玫瑰香半開、已開花期的柱頭表現(xiàn)為最強(qiáng)的可授性，而未開的柱頭均表現(xiàn)有較強(qiáng)的可授性。弗苗無核在含苞待放、半開花期的柱頭表現(xiàn)為最強(qiáng)的可授性，而在已開的柱頭表現(xiàn)為較強(qiáng)的可授性。

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