周軍永　陸麗娟　劉茂　朱淑芳　仇鵬輝　孫其寶

摘要：為了簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）和單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotide polymorphism，SNP）開發(fā)等研究，以李府貢棗不同處理?xiàng)椆麑?shí)的轉(zhuǎn)錄組序列為基礎(chǔ)，分析了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SSR和SNP位點(diǎn)的分布。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共獲得了226 488條contig序列，其中有42 570條unigene在數(shù)據(jù)庫中得到注釋。利用鑒定簡(jiǎn)單重復(fù)序列的軟件（MIcroSAtellite identification tool，MISA）進(jìn)行SSR位點(diǎn)的搜索，共得到18 016個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率為0.43個(gè)/kb。SSR位點(diǎn)共包含164種重復(fù)基元，其中以A/T類型為主的單核苷酸重復(fù)所占的比例最高（6 942個(gè)，38.44%），其次是AG/CT類型為主的二核苷酸重復(fù)（6 113個(gè)，33.85%）和以AAG/CTT為主的三核苷酸重復(fù)（4 242個(gè)，23.49%），四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)基本相同。在轉(zhuǎn)錄組得到的unigene中共發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)163 360個(gè)，發(fā)生頻率為1/254 bp，6種單核普酸變異中以Transition類型的A/G和C/T發(fā)生頻率最高，分別為總數(shù)的30.80%和30.49%;其他4種Transversion類型的SNP為C/G、G/T、A/C和A/T，分別占到總數(shù)的9.83%、978%、9.78%和9.32%。其中Transition類型顯著高于Transversion類型，在轉(zhuǎn)換類型中A/G和C/T發(fā)生頻率基本一致，但以A/G發(fā)生頻率略高。

關(guān)鍵詞：棗;轉(zhuǎn)錄組;SSR;SNP;特征分析

中圖分類號(hào)： S665.101? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0051-04

棗（Ziziphus jujuba Mill.）具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，在我國栽培歷史悠久，是許多省份和地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)林樹種，棗產(chǎn)業(yè)成為當(dāng)?shù)氐闹еa(chǎn)業(yè)之一。我國棗種質(zhì)資源豐富、品種繁多，近年來國內(nèi)外學(xué)者利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeat，ISSR）[1-2]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[3]等分子標(biāo)記技術(shù)在棗的品種分類、鑒別以及遺傳多樣性方面開展了相關(guān)研究工作。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列是由1～6個(gè)堿基組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列，普遍存在于真核生物基因組[4]，SSR按來源可分為有基因組SSR和轉(zhuǎn)錄組來源的SSR[5]，與基因組SSR相比，轉(zhuǎn)錄組來源的SSR無須構(gòu)建基因組文庫等工作。SSR標(biāo)記具有影響轉(zhuǎn)錄、基因調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)功能以及基因組構(gòu)[6-7]，被認(rèn)為是遺傳學(xué)研究中最理想的分子標(biāo)記手段之一[8]，同時(shí)轉(zhuǎn)錄組來源的SSR反映了基因組的編碼區(qū)域，直接獲得物種基因表達(dá)信息，因此EST-SSR多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)[9]。與常規(guī)的AFLP、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）、ISSR等分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、分布廣泛、共顯性遺傳、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，由于棗SSR標(biāo)記開發(fā)較晚，目前SSR標(biāo)記已被應(yīng)用于棗指紋圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系、遺傳多樣性分析等研究領(lǐng)域[10-11]。SNP標(biāo)記是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核普酸替換或較短片段的插入缺失所引起的多態(tài)性，以其分布廣泛、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于的遺傳分析領(lǐng)域，SNPs標(biāo)記在蘋果、西瓜、柑橘、葡萄、柿等作物中得到了開發(fā)和利用[12-13]。目前，在棗中開發(fā)了一些基因組SSR[14]和轉(zhuǎn)錄組SSR標(biāo)記[15]，分別在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上分析了棗微衛(wèi)星的特點(diǎn);而棗SNP研究處于標(biāo)記發(fā)現(xiàn)階段，研究報(bào)道較少。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)李府貢棗不同處理果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)組裝，通過分析其特征為SSR和SNP標(biāo)記的開發(fā)和利用提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)為棗遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化以及構(gòu)建遺傳圖譜奠定基礎(chǔ)，也將為其功能基因的開發(fā)利用、比較基因組學(xué)的研究等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

材料取自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所棗種質(zhì)資源圃，2016年選取樹齡5年，處于盛果期的李府貢棗為試材，當(dāng)棗果實(shí)進(jìn)入白熟期后進(jìn)行灌水處理，分別設(shè)置ZJ（未灌水）、ZJ1（灌水后8 h）、ZJ2（灌水后30 h）、ZJ3（開裂）等4個(gè)處理，處理后分別采集果實(shí)表皮各2份，液氮冷凍后在 -80 ℃ 保存。

1.2 總RNA的提取

采用TRIzol試劑提取棗果實(shí)總核糖核苷酸（RNA），提取后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后利用安捷倫2100芯片生物分析儀（Agilent 2100 Bioanalyzer）檢測(cè)提取的RNA是否達(dá)到轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)組裝

提取的棗果皮總RNA經(jīng)脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）處理后，用帶有多聚胸腺嘧啶[Oligo（dT）]的磁珠富集真核生物信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）。然后加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段，并以打斷后的mRNA為模板用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成1鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），加入緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）和DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase Ⅰ）合成cDNA第2鏈，經(jīng)試劑盒純化回收、黏性末端修復(fù)、3′末端加上堿基“A”和連接測(cè)序接頭，再將得到的片段進(jìn)行大小選擇后PCR擴(kuò)增富集。構(gòu)建好的文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer和美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI StepOnePlus Real-Time PCR System）質(zhì)檢合格后使用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作由深圳市恒創(chuàng)基因科技有限公司完成。對(duì)4份棗果皮樣品測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)過濾掉里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的測(cè)序序列（read）得到干凈序列（clean reads）。利用轉(zhuǎn)錄組Trinity組裝軟件對(duì)所有樣品的干凈序列進(jìn)行混合拼接成轉(zhuǎn)錄本序列，取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本為基因組數(shù)據(jù)庫，得到的基因組數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫用于后續(xù)分析。

1.4 SSR和SNP分析方法

SSR位點(diǎn)搜索主要是利用MISA軟件（http：//pgrc. ipk-gatersleben. de/misa/）搜索得到基因組數(shù)據(jù)庫，其參數(shù)設(shè)置：?jiǎn)螇A基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基的最短重復(fù)次數(shù)分別為12、6、5、5、4、4。

SNP位點(diǎn)的搜索通過Samtool和Picard-tools等工具對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行染色體坐標(biāo)排序、去掉重復(fù)的序列等處理，最后通過變異檢測(cè)軟件UATK3進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記調(diào)用（SNP calling），并對(duì)原始結(jié)果進(jìn)行過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)

提取的總RNA樣品先進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，28S和18S條帶明亮，無雜質(zhì)。

Aligent2100檢測(cè)總RNA樣品質(zhì)量，RNA完整值（RNA integrity number，RIN）都在7.0～8.0之間，總RNA的濃度和總量等指標(biāo)均已達(dá)到測(cè)序要求，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等試驗(yàn)（表1）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝結(jié)果及統(tǒng)計(jì)

棗果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得41 471 760條干凈序列，對(duì)干凈序列進(jìn)行組裝拼接獲得226 488條拼接序列。拼接序列長度范圍主要分布在200～2 000 bp之間，其中以200～300 bp序列數(shù)量居多，約占總拼接序列的61.70%，大于2 000 bp的序列約占總拼接序列的4.64%（表2）。

組裝拼接獲得42 570條基因組數(shù)據(jù)庫，序列長度主要分布在300～3 000 bp范圍內(nèi)，平均長度為974 bp。300～2 000 bp 序列數(shù)量最多，占全部基因組數(shù)據(jù)庫序列的8739%;2 000～3 000 bp 的基因組數(shù)據(jù)庫序列有3 651條，占全部基因組數(shù)據(jù)庫序列的8.58%;≥3 000 bp的基因組數(shù)據(jù)庫序列有1 719條，占 4.04%（表3）。

2.3 微衛(wèi)星特征分析

2.3.1 微衛(wèi)星數(shù)量及分布特點(diǎn) 在轉(zhuǎn)錄組的42 570條基因組數(shù)據(jù)庫序列中發(fā)現(xiàn)18 016個(gè)SSR位點(diǎn)，其中包含1 442個(gè)混合型SSR和13 033個(gè)完整型SSR位點(diǎn)，完整型SSR占總SSR位點(diǎn)的72.3%，包含2個(gè)及以上SSR位點(diǎn)的基因組數(shù)據(jù)庫共有3 762條。SSR位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率為0.43個(gè)/kb，即每2.3 kb就出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)。

SSR位點(diǎn)共包含164種重復(fù)基元，單核苷酸至六核苷酸分別有2、4、10、19、32、97種。其中SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)均在4～35次，重復(fù)4～10次的SSR位點(diǎn)共有10 606個(gè)，占總SSR的58.87%，主要為二核苷酸和三核苷酸;重復(fù)11～16次的SSR位點(diǎn)有3 780個(gè)，占20.98%，主要為單核苷酸和二核苷酸;重復(fù)17～20、21～35次的SSR位點(diǎn)基本為單核苷酸（表4）。

在微衛(wèi)星中，單核苷酸重復(fù)（6 942個(gè)，38.53%）最多，其次是二核苷酸重復(fù)（6 113個(gè)，33.93%）和三核苷酸重復(fù)（4 242個(gè)，23.55%），四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)基本相同（219、242、258個(gè)）（圖2）。

2.3.2 微衛(wèi)星不同優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元堿基的特征分析 SSR位點(diǎn)共包含164種重復(fù)基元，單核苷酸至六核苷酸分別有2、4、10、19、32、97種。通過對(duì)棗不同類型SSR重復(fù)單元數(shù)量的變化的統(tǒng)計(jì)得出頻率最高的4類基序，依次為A/T（6 871個(gè)，38.14%）、AG/CT（3 713個(gè)，20.61%）、AT/AT（1 998個(gè)，1109%）和AAG/CTT（1 462個(gè)，8.12%）。

在2種單核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星中，以A/T為最主要的重復(fù)單元，共有6 871個(gè)，占98.98%，而C/G只占1.02%。

二核苷酸重復(fù)類型有4種（AC/GT、AG/CT、AT/AT和CG/CG），其中AG/CT重復(fù)的數(shù)量最多，共有3 713個(gè)，占二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星總數(shù)的60.74%;其次是AT/AT（1 998個(gè)），占32.68%;再次是AC/GT（396個(gè)），占6.48%;而CG/CG只有6個(gè)，占0.10%（圖3）。

三核苷酸重復(fù)類型有10種，AAG/CTT重復(fù)的數(shù)量最多，共有1 462個(gè)，占4.46%;其次是AAT/ATT（645個(gè)）、ACC/GGT（521個(gè)）、ATC/ATG（477個(gè)）;再次是AAC/GTT（360個(gè)）、AGG/CCT（298個(gè)）、AGC/CTG（283個(gè)），其他重復(fù)類型則相對(duì)較少。

在19種四核苷酸重復(fù)類型中，以AAAT/ATTT重復(fù)數(shù)量最多，共113個(gè)，占四核苷酸SSR總數(shù)的51.60%;其次為AAAG/CTTT，有27個(gè)，占12.33%。五核苷酸重復(fù)類型有32種，AAAAT/ATTTT重復(fù)數(shù)量最多，有104個(gè)，占42.98%。六核苷酸重復(fù)類型有97種，共258個(gè)，但每種重復(fù)類型數(shù)量都較少。

通過對(duì)棗果實(shí)轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星數(shù)量分析可知，單核苷酸重復(fù)次數(shù)主要集中在12～20次，且隨著重復(fù)次數(shù)增加呈遞減趨勢(shì)，未發(fā)現(xiàn)重復(fù)24次以上的單核苷酸微衛(wèi)星序列。二核苷酸微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)集中在6～11次;三核苷酸微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)集中在5～8次;四核苷酸微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)集中在5～6次;而五核苷酸微衛(wèi)星和六核苷酸微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)最少，為4～5次。

2.3.3 微衛(wèi)星長度分布 微衛(wèi)星長度也存在極顯著變異，長度變化范圍為12～248 bp，平均長度為21 bp。以重復(fù)長度為10～20 bp的短序列最多，占80.12%;其次為長度在21～29 bp 的序列，占總數(shù)的12.18%;長度大于50 bp的長序列占微衛(wèi)星總數(shù)的4.36%（圖4）。

2.4 SNP位點(diǎn)的特征分析

在轉(zhuǎn)錄組得到的基因組數(shù)據(jù)庫中共發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)163 360個(gè)，發(fā)生頻率為1/254 bp，即每254 bp就會(huì)有1個(gè)SNP位點(diǎn)出現(xiàn)，其中轉(zhuǎn)換100 122個(gè)，顛換63 238個(gè)。6種單核苷酸變異中以轉(zhuǎn)換類型的A/G和C/T發(fā)生頻率最高，分別為總數(shù)的30.80%和30.49%;其他4種顛換類型的SNP為C/G、G/T、A/C和A/T，分別占到總數(shù)的9.83%、9.78%、9.78%和932%。其中轉(zhuǎn)換類型顯著高于顛換類型，在轉(zhuǎn)換類型中 A/G 和C/T發(fā)生頻率基本一致，但以A/G發(fā)生頻率略高。

3 結(jié)論與討論

在李府貢棗轉(zhuǎn)錄組的42 570條基因組數(shù)據(jù)庫序列中發(fā)現(xiàn)18 016個(gè)SSR，其中包含1 442個(gè)混合型SSR和13 033個(gè)完整型SSR位點(diǎn)，SSR位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率為0.43個(gè)/kb，比桃（0.31）、棗（0.36）出現(xiàn)頻率[15-16]低，與柿SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率[13]相同，表明本研究中李府貢棗SSR標(biāo)記的數(shù)量極其豐富，有望在SSR引物開發(fā)、遺傳多樣性等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組獲得的微衛(wèi)星中單核苷酸重復(fù)最多，占38.44%;其次是二核苷酸重復(fù)（33.85%）和三核苷酸重復(fù)（23.49%），四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)基本相同，與前人關(guān)于棗轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星特征基本相同，但本研究獲得258個(gè)六核苷酸重復(fù)類型?；蚪M序列的微衛(wèi)星特征與轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星序列相比，六堿基重復(fù)微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率明顯高于其他類型，棗轉(zhuǎn)錄組比基因組低級(jí)基元頻率高，而高級(jí)基元比基因組的低，與前人研究[14-15]基本一致。

SSR位點(diǎn)共包含164種重復(fù)基元，單核苷酸至六核苷酸分別有2、4、10、19、32、97種。其中SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)均在4～35次，重復(fù)4～10次的SSR位點(diǎn)共有10 606個(gè)，占總SSR的58.87%，主要為二核苷酸和三核苷酸;重復(fù)11～16次的SSR位點(diǎn)有3 780個(gè)，占20.98%，主要為單核苷酸和二核苷酸;重復(fù)17～20次和21～35次的SSR位點(diǎn)基本為單核苷酸。SSR長度變化范圍為10～248 bp，平均長度為 21 bp，以重復(fù)長度為10～20 bp的短序列最多，占80.07%。

通過對(duì)本研究結(jié)果分析可知，單核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星為棗最優(yōu)勢(shì)微衛(wèi)星，所占比例最多，而且單核苷酸微衛(wèi)星重復(fù)單元次數(shù)的變化明顯高于其他重復(fù)類型，其次是二核苷酸微衛(wèi)星，說明單核苷酸在整個(gè)棗轉(zhuǎn)錄組中變異最為活躍。此外，SSR序列以重復(fù)長度為10～20 bp的短序列最多，此類SSR位點(diǎn)擁有高度多態(tài)性。SSR的長度和重復(fù)次數(shù)是影響分子標(biāo)記多態(tài)性的重要因素[17]，說明轉(zhuǎn)錄組獲得的SSR位點(diǎn)可為棗遺傳多樣性和親緣關(guān)系等研究有重要的價(jià)值。

單核苷酸多態(tài)性在植物基因組中廣泛存在[18-19]。本研究中共發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)163 360個(gè)，發(fā)生頻率為1/254 bp，與柿發(fā)生頻率[13]基本一致，但與水稻和玉米等作物相比發(fā)生頻率低。所獲得的SNP位點(diǎn)中Transition類型顯著高于Transversion類型。6種單核普酸變異中以Transition類型的A/G和C/T發(fā)生頻率最高。轉(zhuǎn)錄組來源的SSR、SNP多位于基因組的編碼區(qū)域，可直接獲得物種基因表達(dá)信息，可能與基因功能直接相關(guān)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為SSR和SNP標(biāo)記的開發(fā)和利用提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)為棗遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化以及構(gòu)建遺傳圖譜奠定基礎(chǔ)，也將為其功能基因的開發(fā)利用、比較基因組學(xué)、分子輔助育種等研究提供依據(jù)。

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