何必庭，何秋陽，劉濟(jì)銘，史雙龍，高世輪，翁學(xué)煌，賈黎明

（1.龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 龍泉 323700；2.北京林業(yè)大學(xué) 國家能源非糧生物質(zhì)原料研發(fā)中心，北京 100083；3.福建源華林業(yè)生物科技有限公司，福建 三明 354500）

無患子Sapindus mukorossi為無患子科Sapindaceae無患子屬Sapindus落葉喬木，廣泛分布于亞洲和美洲的熱帶、亞熱帶低山丘陵及石灰?guī)r地區(qū)[1-3]，主要在我國秦嶺淮河以南以散生或小居群形式分布。無患子果皮皂苷和種仁油脂含量豐富，是重要的生物日化、生物柴油、生物醫(yī)藥等原料樹種[2-3]。目前，在我國福建、浙江、貴州、云南、湖南等地已陸續(xù)發(fā)展了數(shù)萬公頃的人工原料林[4]，但目前栽植多為未經(jīng)子代測定的實(shí)生群體，普遍產(chǎn)量較低。其主要原因是缺乏優(yōu)良品種及其繁育技術(shù)。

扦插育苗是林木優(yōu)良品種無性快速擴(kuò)繁的重要手段之一，由于其繁殖系數(shù)高、繁殖速度快、操作簡易等優(yōu)勢在實(shí)際生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[5-6]。嫩枝扦插是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，受不同植物、不同品種、不同個(gè)體、環(huán)境以及扦插基質(zhì)、插穗自身狀況、生根激素或生根粉的種類與濃度等因素的影響，成活率表現(xiàn)出巨大差異[7-10]。國內(nèi)外關(guān)于無患子扦插技術(shù)的研究已有相關(guān)報(bào)道，主要集中在扦插插穗類型、扦插基質(zhì)、扦插時(shí)間和激素處理的優(yōu)選過程。在對無患子扦插試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過一定濃度的激素浸泡處理并對扦插環(huán)境加以控制，無患子扦插的成活率可達(dá)70%以上[11-13]，而阮雙興[14]發(fā)現(xiàn)不同濃度NAA處理的無患子穗條成活率不足46%，2年生插穗成活率不足33%。這些差異可能是由于扦插的基質(zhì)、插穗狀況、處理方式等不同導(dǎo)致。目前尚無試驗(yàn)總結(jié)出無患子可應(yīng)用于生產(chǎn)的系統(tǒng)扦插擴(kuò)繁技術(shù)，關(guān)于無患子扦插生根機(jī)理更是未見相關(guān)報(bào)道。

在借鑒無患子科樹種扦插擴(kuò)繁技術(shù)國內(nèi)外研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，本文以無患子為研究對象，采用不同激素處理研究無患子嫩枝扦插的生根機(jī)理，以期找到適用于無患子的簡單快速無性繁殖育苗途徑，探索其生根機(jī)理，為無患子優(yōu)良種質(zhì)快繁提供理論與技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于福建省西北部的三明市建寧縣，116°35'～117°04'E，26°30'～27°06'N，閩江源頭[15]，海拔280～1 858 m，年平均氣溫16.5～17.5℃，年平均降水量1 800～2 100 mm，多集中于春夏兩季，常年相對濕度84%，平均日照時(shí)數(shù)達(dá)1 721 h[16]。土壤為長石砂巖風(fēng)化母質(zhì)上發(fā)育而成的厚層山地黃紅壤，土層厚度＞100 cm，多以紅壤為主[17]，質(zhì)地多為重壤土（卡氏制）至輕黏土，肥力較高，具有良好的水濕條件，適宜林木生長[18]。建寧縣森林覆蓋率達(dá)78.3%，植物種類多達(dá)1 300種，近年來大力發(fā)展無患子原料林培育，2012年獲中國經(jīng)濟(jì)林協(xié)會授予“中國無患子之鄉(xiāng)”稱號，是我國發(fā)展無患子生物質(zhì)能源原料林的主要基地。

本試驗(yàn)在福建省建寧縣斗埕工業(yè)區(qū)源容生物科技有限公司扦插大棚中進(jìn)行。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選自福建省建寧縣無患子家系種質(zhì)資源圃。2017年6月中上旬于晴朗清晨采集3年生實(shí)生苗當(dāng)年生無病蟲害健壯嫩枝，長20～100 cm，直徑1.5～2 cm。插穗制作在背陰地進(jìn)行，剪除梢部和基部，下端剪成馬蹄形斜切面，上端平切面，去除幼嫩梢部，插穗長10～13 cm。每段插穗保留2～3個(gè)芽眼，除去下部所有葉片，保留上部1～2片小葉，葉量較多或葉片過大時(shí)將葉片剪去一半或1/3，隨采隨插隨處理。

扦插基質(zhì)采用泥炭土：珍珠巖以2：1的比例均勻混合，將基質(zhì)盛裝在口徑10 cm，深20 cm的PVC育苗容器內(nèi)，使用1：200 0的多菌靈溶液（多菌靈型號：Zhb/中保生產(chǎn)的PD85150-2殺菌劑XK13-003-00387）澆透容器內(nèi)基質(zhì)進(jìn)行消毒。在扦插大棚內(nèi)苗床上挖淺坑，間距25 cm×15 cm，將盛裝好基質(zhì)的容器放置在淺坑內(nèi)，并用土壘實(shí)，防止容器翻倒。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置3種激素的3種不同濃度，加上清水對照（CK）共10個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25個(gè)插穗。激素選用NAA，IAA，GGR6的不同濃度溶液處理插穗，激素濃度分別為 100 mg·L-1，200 mg·L-1，500 mg·L-1，處理時(shí)間將插穗基部4 cm左右激素浸泡1 h，激素種類與濃度組合設(shè)計(jì)見表1。

為便于觀察扦插苗生根情況，另取100根插穗使用200 mg·L-1GGR6處理1 h并進(jìn)行扦插，作為破壞性試驗(yàn)所需的扦插苗。

表1 不同激素處理及水平Table1 Different hormones with different levels

2.3 插后管理

將處理后的插穗直插入基質(zhì)中，芽眼朝上，插穗上端3～5 cm露出基質(zhì)，插后將孔口縫隙捏實(shí)以使插穗基部與基質(zhì)完全接觸。扦插后采用棚內(nèi)自動噴霧裝置進(jìn)行管理（10:00-17:00，每30 min噴霧1次，每次3 min），噴霧同時(shí)起到了維持空氣濕度和基質(zhì)水分的作用，使白天棚內(nèi)空氣溫度維持在25～30℃，相對空氣濕度在80%左右，同時(shí)扦插基質(zhì)始終保持濕潤狀態(tài)。生根后則適當(dāng)控制水分，并噴施2 000倍液的多菌靈。及時(shí)除去棚中雜草。陰雨天適當(dāng)關(guān)閉噴霧裝置，防止水分過多導(dǎo)致棚內(nèi)過于潮濕，使扦插苗澇死。

2.4 扦插育苗生根解剖學(xué)研究

扦插后每隔5 d將破壞性試驗(yàn)苗隨機(jī)拔出1～2根，觀察愈傷組織生長及生根情況。扦插前取3根未經(jīng)處理的插穗，扦插后每隔2周隨機(jī)抽取3根插穗進(jìn)行觀察并保存，與未處理的插穗一起制作石蠟切片，取代表性切片通過顯微鏡觀察拍照。

2.5 指標(biāo)測定方法

2.5.1 插穗成活率的測定 2017年11月對扦插成活率進(jìn)行觀測統(tǒng)計(jì)。

2.5.2 幼苗生物量、根系指標(biāo)的測定 在觀測結(jié)束后對無患子扦插苗進(jìn)行采樣。每個(gè)處理隨機(jī)采集3株扦插苗全部葉片與根系，分別放入信封并標(biāo)號，當(dāng)天將葉片烘干至恒重，使用電子天平（賽多利斯公司產(chǎn)，型號SQP）稱量其生物量并記錄；將根系清水洗凈，用EPSON掃描儀（EPSON公司產(chǎn)，型號V19）和Epson Twain Pro根系掃描系統(tǒng)進(jìn)行掃描，得到根系數(shù)據(jù)。掃描結(jié)束后將根系裝回信封并烘干至恒重，使用電子天平稱量其生物量并記錄。稱量后的根、葉裝回信封保存待測。

2.5.3 幼苗營養(yǎng)成分的測定 將烘干后的根、莖、葉樣品使用球磨儀（德國RETSCH，冷凍混合研磨儀MM400）粉碎并保存在干燥潔凈的自封袋中并標(biāo)上樣品序號。按照消煮流程將樣品消煮后，將得到的消煮液倒入標(biāo)有樣品序號的100 ml小口方瓶（hdpe材質(zhì)方形水劑瓶）內(nèi)待測。

使用AA3連續(xù)流動化學(xué)分析儀（德國SEAL產(chǎn)，型號AA3）測定待測樣品的含磷量與含氮量。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 20對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-wayANOVA分析，如處理間差異顯著，采用Duncan法在0.05或0.01水平上進(jìn)行多重比較。采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行圖表繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 嫩枝扦插成苗過程及其生根類型

嫩枝扦插過程中，愈傷組織約在25 d后出現(xiàn)，28 d時(shí)大量形成愈傷組織，33 d出現(xiàn)不定根，40 d正常生長形成茁壯苗木，70 d根團(tuán)形成，扦插苗木可移栽定植（圖1）。對不同時(shí)期無患子嫩枝扦插苗木通過形態(tài)觀測和切片觀察，發(fā)現(xiàn)嫩枝扦插苗于28 d于皮下形成根原基，33 d形成不定根（圖2），生根部位多集中于皮下和愈傷組織中（圖3）。

圖1 無患子嫩枝扦插苗（200 mg·L-1GGR6處理）15，30，70 d時(shí)生根情況Figure1 Rooting of cuttings 15,30 and 70 days after treatment of 200 mg·L-1GGR6

圖2 無患子扦插苗皮下生根（左）與愈傷組織生根（右）Figure2 Rooting from hypodermis(left)and callus(right)of cutting

圖3 無患子嫩枝扦插基部切片觀測Figure3 Slice observation of cutting base

3.2 不同激素處理對嫩枝扦插成活率的影響

研究表明（圖4），采用GGR6，IAA及NAA處理可顯著提高無患子嫩枝扦插成活率（P＜0.05），方差分析表明多數(shù)處理與對照相比差異顯著（P＜0.05）（除c’13，c’22，c’32）。多重比較發(fā)現(xiàn)c’31處理下成活率顯著高于其他處理（P＜0.05），扦插成活率可達(dá)46.96%，比CK高42.24%；其次是c’12處理成活率達(dá)33.15%。綜合分析認(rèn)為，200 mg·L-1GGR6處理成活率最高，500 mg·L-1IAA處理成活率最高，100 mg·L-1NAA處理成活率最高。

3.3 不同激素處理對嫩枝扦插苗生物量的影響

由圖5分析表明，各處理相比于CK，扦插苗生物量均有所提高，其中部分處理差異顯著（P＜0.05）。c’31處理的總生物量生長最高達(dá)到3.05 g，比CK處理高出將近6.5倍；平均每株扦插苗根、葉最高生物量分別達(dá)到1.32 g，1.73 g，分別比CK高出915%，409%。多重比較發(fā)現(xiàn)c’31處理嫩枝扦插苗根、葉總生物量最高，其次為c’22。綜合分析也發(fā)現(xiàn)隨著GGR6，NAA激素處理濃度的升高，嫩枝扦插苗根、葉生物量都逐漸下降，IAA激素則在200 mg·L-1處達(dá)到峰值，500 mg·L-1處跌入谷底。

圖4 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插成活率 Figure4 Survival rate of cuttings treated by different hormones and different concentrations

注：圖中不同字母表示差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），下同。

3.4 不同激素處理對嫩枝扦插苗營養(yǎng)成分的影響

由圖6可看出，各處理相比于CK，嫩枝扦插苗根、莖、葉含氮量均有所提高，最高的分別是c’22，c’33，c’11，達(dá)到 4.90 mg·kg-1，3.50 mg·kg-1，6.04 mg·kg-1，分別比 CK 高出 227%，90%，158%。方差分析表明多數(shù)處理根、莖、葉含氮量存在顯著性差異。多重比較表明，IAA，NAA處理下根含氮量顯著高于CK與GGR6處理（P＜0.05），在500 mg·L-1NAA處理下的莖含氮量顯著高于其他處理（P＜0.05），在100 mg·L-1GGR6處理下葉含氮量顯著高于其他處理（P＜0.05）。分析認(rèn)為GGR6可有效提高嫩枝扦插苗葉含氮量，NAA能有效提高根、莖部分含氮量。

圖6 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗根、莖和葉的含氮量Figure6 Nitrogen content in root,stem and leaf of cutting treated by different hormones and concentrations

圖7 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗 根、葉的含磷量Figure7 Phosphorus content in root and leaf of cuttings treated by different hormones and concentrations

由圖7可知，各處理相比于CK，嫩枝扦插苗葉、根含磷量均有所提高，大部分處理莖含磷量并無顯著差異，其中c’21處理下葉含磷量最高，達(dá)到2.47 mg·kg-1，比CK處理高出1.51 mg·kg-1；c’11處理下根含磷量最高，達(dá)到1.34 mg·kg-1，比CK處理高出1.2 mg·kg-1。方差分析表明，多數(shù)處理間有極顯著差異（P＜0.01）。多重比較表明c’21和c’11的葉、根含磷量顯著高于其他處理（P＜0.05），同時(shí)在各激素中低濃度處理下根含磷量差異并不顯著，但顯著區(qū)別于CK、c’23和c’33處理（P＜0.05）。

3.5 不同激素處理對嫩枝扦插苗根系的影響

各處理根系總根長、根表面積、根體積及平均直徑均顯著高于CK（P＜0.05）（圖8至圖11）。其中c’31扦插苗總根長、根表面積及根體積均為最高，達(dá)到15.65 m，170.25 cm2，2.19 cm3，分別高出CK 15.1倍、7.17倍、13.06倍。單因素方差分析、多重比較也發(fā)現(xiàn)c’31的根系指標(biāo)顯著高于其他處理，表明NAA100 mg·L-1處理確實(shí)可以有效提高嫩枝扦插苗根系的生長。此外NAA處理下無患子嫩枝扦插苗根系總根長、表面積及根體積也顯著高于GGR6和IAA處理，分析認(rèn)為NAA相比于IAA和GGR6可更有效促進(jìn)無患子嫩枝扦插苗根系的生長。

圖8 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗總根長Figure8 Total root length of cuttings treated by different hormones and concentrations

圖9 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗根表面積Figure9 Root surface area of cuttings treated by different hormones and concentrations

圖10 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗根體積Figure10 Root volume of cuttings treated by different hormones and concentrations

圖11 不同激素及濃度下無患子嫩枝扦插苗根平均直徑Figure11 Mean root diameter of cuttings treated by different hormones and concentrations

4 結(jié)論與討論

4.1 無患子嫩枝扦插的生根型

扦插插穗生根過程可概括為：根原始體轉(zhuǎn)變分生組織，進(jìn)一步分化為根原基，從而形成不定根[19-21]。按照根原基形成的部位、時(shí)間以及形成機(jī)制，可將插穗生根類型分為三種，即皮部生根型[21-22]、愈傷組織生根型[23]和中間生根型[24-27]。在無患子科的扦插研究中，宗建偉發(fā)現(xiàn)文冠果Xanthoceras sorbifolium生根類型屬于愈傷組織生根[28]。國內(nèi)外對于無患子嫩枝扦插的相關(guān)試驗(yàn)中鮮見對嫩枝扦插生根機(jī)理的研究[11-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)無患子嫩枝扦插過程中，扦插后25 d出現(xiàn)愈傷組織，33 d出現(xiàn)不定根，40 d后可生長形成健壯苗木。通過不同時(shí)期切片觀測，發(fā)現(xiàn)扦插后28 d皮下形成根原基，33 d后形成不定根，且生根部位多集中于皮下和愈傷組織中。因此推測無患子嫩枝扦插生根方式屬于皮部生根型和愈傷組織生根型相結(jié)合的方式，即中間生根型。

4.2 外源激素處理對無患子嫩枝扦插的影響

研究表明植物營養(yǎng)物質(zhì)、生長激素、生根輔助因子及抑制劑對插穗生根過程中發(fā)生的生理生化變化有著重要影響[28-31]。宗建偉[32]等研究發(fā)現(xiàn)IBA 795～820 mg·L-1處理對文冠果扦插苗不同徑級根長、根表面積、根體積等根系指標(biāo)造成顯著影響，改變根系的形態(tài)構(gòu)成。程水源等試驗(yàn)表明扦插不定根的形成與扦插苗內(nèi)酶與內(nèi)源激素的含量相關(guān)[31,33]。

本研究對無患子嫩枝采用了GGR6，IAA及NAA不同濃度進(jìn)行處理，扦插成活率有不同程度的提高，其中NAA100 mg·L-1處理成活率可達(dá)到46.96%，較CK處理高42.24%。同時(shí)NAA處理可有效促進(jìn)插穗根系生長，NAA 100 mg·L-1處理下扦插苗當(dāng)年總根長（15.65 m）、根表面積（170.25 cm2）及根體積（2.19 cm3）均達(dá)到峰值，分別比CK高出15.1倍、7.17倍、13.06倍。不同激素處理也可提高無患子嫩枝扦插苗根、莖、葉生物量和營養(yǎng)成分，其中NAA100 mg·L-1處理下根、葉當(dāng)年總生物量最高?？梢娨欢舛燃に靥幚韺o患子嫩枝扦插有顯著促進(jìn)作用，其中NAA相比于GGR6和IAA能更有效促進(jìn)無患子嫩枝扦插苗成活及生長，本試驗(yàn)中NAA 100 mg·L-1處理為無患子嫩枝扦插的最優(yōu)激素處理。

研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著各激素處理濃度提升，無患子嫩枝扦插成活率并無顯著差異，而嫩枝扦插苗的根、葉生物量呈現(xiàn)下降趨勢，推測隨著激素濃度過高可造成一定程度的生長抑制。營養(yǎng)成分也表現(xiàn)出類似規(guī)律，隨著各激素濃度的升高，嫩枝扦插苗木根系總根長、根表面積及根體積均呈現(xiàn)下降趨勢，推測隨著激素濃度的升高，表現(xiàn)出對嫩枝扦插苗木根系生長一定的抑制作用。

4.3 無患子嫩枝扦插技術(shù)初步總結(jié)

通過試驗(yàn)得出無患子嫩枝扦插繁殖的最佳技術(shù)，無患子嫩枝扦插應(yīng)采集生長健壯母樹當(dāng)年生枝條制穗，插穗長度10～13 cm，每段插穗保留2～3個(gè)芽眼，除去下部所有葉片，保留上部1～2片小葉。采用NAA激素100 mg·L-1浸泡插穗基部1 h。設(shè)置自動噴霧裝置保證空氣濕度，并采用遮陽網(wǎng)遮光，避免強(qiáng)光蒸騰失水死亡。結(jié)合以上的技術(shù)組合，無患子嫩枝扦插成活率可達(dá)45%以上。