余 琪，張深梅，鄭 浩，葉 磊，張紫昀，趙佳倩，胡淵淵，黃春穎

（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

山核桃Carya cathayensis是胡桃科Juglandaceae山核桃屬Carya植物，主產(chǎn)于浙江臨安、淳安、安吉及安徽等地，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。美國山核桃C.illinoensis，原產(chǎn)美國和墨西哥。湖南山核桃C.hunanensis，主產(chǎn)于湖南、貴州、廣西等地。這三種山核桃屬植物以實(shí)生和無性繁殖為主要方法，但實(shí)生繁殖變異大，所以通過嫁接進(jìn)行無性繁殖的方法最普遍。嫁接具有保持和發(fā)展優(yōu)良種性，加速優(yōu)種的繁殖，成活率高，遺傳增益高，提早促進(jìn)植株開花結(jié)果進(jìn)入豐產(chǎn)期等優(yōu)點(diǎn)，推動了農(nóng)林業(yè)的發(fā)展，縮短了苗木的培育年限[2-3]。一般情況下，山核桃實(shí)生樹進(jìn)入結(jié)果年齡需13～14 a，嫁接樹則5～6 a即可開花結(jié)果，20～30 a后進(jìn)入盛果期，在立地條件好的地方，50～60 a樹齡的老樹仍能結(jié)實(shí)良好[4]。因而更好利用嫁接技術(shù)，打破山核桃良種缺乏的現(xiàn)狀成為了當(dāng)代學(xué)者研究熱潮。

黃堅(jiān)欽等[5]認(rèn)為不同接穗及生長枝不同接芽部位對嫁接成活率有顯著影響，1年生枝（實(shí)生苗）＞生長枝＞結(jié)果枝，接芽部位以生長枝第4至第7側(cè)芽成活最好，砧木圃接成活好于移栽成活，但可嫁接的時(shí)間較移栽短。王白坡等[6]研究發(fā)現(xiàn)山核桃成年樹的接穗本砧嫁接成活率在41%以下，而苗木枝條為接穗則可達(dá)90%～93%，但缺少實(shí)用價(jià)值；化香樹Platycarya strobilacea砧和山核桃成年樹接穗成活率為84%～88%，但保存率低，存在不親和現(xiàn)象。王紅紅[7]和常君等[8]的研究得出相似結(jié)論：山核桃和湖南山核桃親和性良好，嫁接成活率為本砧嫁接的2.1倍，且以湖南山核桃為砧木時(shí)，接穗萌芽率最高，生長量最大，以美國山核桃為砧木嫁接山核桃和湖南山核桃親和性好，但以山核桃和湖南山核桃為砧木嫁接美國山核桃親和性差。

山核桃嫁接從上世紀(jì)60年代開始，到本世紀(jì)初得到了突破，嫁接成活研究促進(jìn)了山核桃良種化進(jìn)程。在長期的實(shí)踐過程中，用美國山核桃和湖南山核桃為砧木，山核桃嫁接成活率高、適生范圍大，是目前廣泛使用的方法。國內(nèi)外學(xué)者在營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用、水分及養(yǎng)分的運(yùn)輸、生理生化特性、形態(tài)與解剖、遺傳特性、嫁接愈合過程砧穗間相互關(guān)系以及內(nèi)源、外源激素對砧穗的影響方面進(jìn)行了較多的研究，但對于山核桃屬種間嫁接親和性研究較少，且到目前為止對砧穗間相互影響機(jī)制仍未有一個(gè)較合理的解釋[9]。為此，本研究對山核桃、湖南山核桃、美國山核桃的嫁接成活率和嫁接苗的生長進(jìn)行不同砧穗組合的親和性比較，尋找差異來源，從而進(jìn)一步提高嫁接成活率、提高果實(shí)產(chǎn)量并優(yōu)化果實(shí)品質(zhì)、擴(kuò)大栽種范圍，對山核桃的生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于浙江農(nóng)林大學(xué)山核桃試驗(yàn)林基地（119°43′E，30°14′N）。地勢平緩，屬亞熱帶季風(fēng)性氣候的北緣，溫暖濕潤，四季分明，年平均氣溫16.4℃。年平均降水量1 628.6 mm，全年日照時(shí)數(shù)1 939 h，全年無霜期234 d。土壤為紅壤類的黃泥土，pH 5.5～6.5。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選取2年生美國山核桃、湖南山核桃和山核桃實(shí)生苗作為砧木，均來自浙江杭州臨安玲瓏山山核桃育苗基地（119°39′E，30°12′N）；穗條都為同一基地地方山核桃良種結(jié)果樹上的1年生生長枝，取材部位大致相同，枝條平直，生長狀態(tài)相似，無病蟲害。2017年4月2日采取切接方式，在砧木距根莖處6～10 cm光滑處剪斷，并削平斷面，然后選擇砧木皮層平滑的一面，在斷面下近0.5 cm處，用切接刀向上斜削一刀，在砧木上部削一小斜面，在斜面下部1/3處向下縱切一刀，切口深2～3 cm，使切開的小片連而不斷；接著用切接刀把準(zhǔn)備好的接穗在芽側(cè)面，距芽下部約1.5～2.0 cm處，向下削成45°斜面，再在斜面背面距離芽下部約0.5～1.0 cm處向下向前平削成直削面，深至皮層與木質(zhì)部之間，削去的表皮不帶木質(zhì)或稍帶木質(zhì)，而恰到形成層，接穗削好后，將直削面朝里迅速插入砧木切口，對準(zhǔn)形成層，然后用塑料薄膜帶由下而上進(jìn)行綁扎，包好砧木傷口及接穗頂端削口，露出芽體。嫁接由1人完成，每種砧木嫁接苗50株。早期管理措施基本相同（15～20 d早期除萌，夏季采用市場上3針黑色遮陰網(wǎng)進(jìn)行遮陰等）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生長觀測 嫁接后30 d，以接穗上芽萌發(fā)展葉作為嫁接成活的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)3種嫁接苗的成活率。之后隨機(jī)選取每一種嫁接苗20株，對其進(jìn)行生長期觀測，于嫁接后50 d，80 d，110 d時(shí)對砧木地徑、新梢直徑（新梢上距嫁接處1 cm）、新梢長度、復(fù)葉數(shù)進(jìn)行測定，計(jì)算出節(jié)間平均長度。6月18日葉片成熟后，對3種類型嫁接苗相同高度的復(fù)葉上不同方位小葉（頂葉、側(cè)葉1、側(cè)葉2）的葉長、葉寬用刻度尺進(jìn)行測量，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.2 熒光參數(shù)的測定 嫁接后60 d和100 d時(shí)采集三種嫁接苗朝陽面距地面30 cm左右長勢相似的葉片，每種嫁接苗各五株，每株各3片，采用PAM-2100熒光儀（德國COUNTRYOFOPIGINWALZ）測定葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，測定前均進(jìn)行充足的暗適應(yīng)（30 min），測定時(shí)每葉片選取不在葉脈上且距離葉脈大致相等的5個(gè)點(diǎn)，取數(shù)據(jù)平穩(wěn)后5個(gè)點(diǎn)的平均值計(jì)算，F(xiàn)v’/Fm’=（Fm’-Fo’）／Fm’代表光合反應(yīng)中心PSⅡ的光合效率，表示光合反應(yīng)中心在部分關(guān)閉的情況下實(shí)際捕獲能量的傳遞效率。NPQ=（Fm-Fm’）／Fm’為非光化學(xué)猝滅，Y（Ⅱ）為PSⅡ的光量子產(chǎn)額，ETR為電子傳遞效率。方法詳見尤鑫等[10]。

1.3.3 葉綠素含量的測定 嫁接后120 d，采集3種嫁接苗朝陽面距地面30 cm左右長勢相似的完全成熟葉片，每種各3片，遮光下剪碎同類型嫁接苗葉片并混合均勻稱取0.1 g，放入離心管，加入8 mL95%酒精，遮光靜置48 h后搖勻，利用UV-2600紫外分光光度計(jì)（日本，SHIMADZU島津）在波長470 nm，663 nm，645 nm下測定光密度（OD）值，每份樣品測3次，取平均值，按照以下公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量：

Ca=（12.7OD663-2.69OD645）*[V/（1 000*W）]

Cb=（22.9OD645-4.63OD663）*[V/（1 000*W）]

Cc=（1 000OD470-2.05Ca-114.8Cb）/245

式中：V—葉綠素提取液總體積（10 mL），W—所用葉片鮮質(zhì)量（g）；Ca為葉綠素a的質(zhì)量濃度，Cb為葉綠素b的質(zhì)量濃度，Cc為類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度，單位都是mg·g-1，單位體積混合物中某組分的質(zhì)量稱為該組分的質(zhì)量濃度。方法詳見張其德[11]。

1.3.4 嫁接部位的切片 嫁接后150 d，選取生長狀況相近的具有代表3種嫁接苗生長特性的植株各3株，截取砧木與接穗連接處3 cm左右部位，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，采用滑走式切片機(jī)，制作臨時(shí)切片，顯微觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)采用Excle 2009軟件進(jìn)行計(jì)算和分析，其獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和方差分析處理均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，多重比較采用LSD法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同砧木對山核桃嫁接苗成活率的影響

由圖1可知，3種嫁接苗在嫁接30 d后的成活率存在差異。湖南山核桃為砧木的嫁接苗成活率最高，為92.66%；美國山核桃為砧木的嫁接苗成活率為90.45%；而山核桃本砧嫁接苗僅為76.34%，而且后期還出現(xiàn)了大量死亡的現(xiàn)象

2.2 不同砧木類型對山核桃嫁接苗生長量的影響

對不同砧木的嫁接苗生長量進(jìn)行多重比較，結(jié)果見表1。結(jié)果表明不同砧木嫁接組合在砧木地徑的生長之間差異不明顯，但在接穗直徑、每株復(fù)葉數(shù)、新梢高度和節(jié)間長度等不同砧木之間均表現(xiàn)出顯著差異。從嫁接80 d到110 d，以美國山核桃和湖南山核桃為砧木的嫁接苗接穗直徑分別增加了2.4 mm和1.6 mm，而山核桃本砧嫁接苗直徑卻未發(fā)生明顯的變化。從嫁接后50 d到110 d，以美國山核桃、湖南山核桃和山核桃為砧木的嫁接苗新梢長度平均生長量分別為42.2 cm，60.7 cm和19.7 cm，每株復(fù)葉數(shù)平均增加了3.27片，6.01片和3.77片。

圖1 不同砧木山核桃嫁接成活率Figure1 Survival rate of grafted seeding on different rootstocks

表1 不同砧木山核桃嫁接苗生長量的比較Table1 Growth of grafted seedlings on different rootstocks

2.3 不同砧木對山核桃嫁接苗葉片形態(tài)的影響

不同砧木山核桃嫁接苗葉片形態(tài)的多重比較見表2。以美國山核桃和湖南山核桃為砧木的嫁接苗的頂葉，側(cè)葉1，2的長、寬均與山核桃本砧嫁接苗之間存在顯著差異，且前兩者均大于后者。以美國山核桃為砧木的嫁接苗頂葉和側(cè)葉1的形態(tài)大于以湖南山核桃為砧木的同方位的小葉，而側(cè)葉2則小于以湖南山核桃為砧木的嫁接苗。

表2 不同砧木山核桃嫁接苗葉片形態(tài)差異Table2 Morphological differences of grafted seedling leaves on different rootstocks

2.4 不同砧木對山核桃嫁接苗葉片熒光參數(shù)的影響

如表3所示，不同組合的嫁接苗在不同時(shí)間其Y（Ⅱ），NPQ，ETR的差異不顯著，只有PSⅡ Fv’/Fm’在嫁接后不同天數(shù)上存在顯著差異。有效Fv’/Fm’可反映出開放的PSII反應(yīng)中心原初光能捕獲效率，表明嫁接苗在嫁接后90 d的光能捕獲效率低于嫁接后60 d。

表3 不同砧木山核桃嫁接苗熒光參數(shù)變化Table3 Changes of fluorescence parameters of grafted seeding on different rootstocks

2.5 不同砧木類型對山核桃嫁接苗葉片葉綠素與類胡蘿卜素含量（鮮質(zhì)量）的影響

由圖2可知，以湖南山核桃為砧木的嫁接苗葉綠素含量最高，葉綠素a含量為1.406 mg·g-1，葉綠素b含量為3.951 mg·g-1，類胡蘿卜素含量為1.143 mg·g-1；山核桃本砧嫁接苗葉綠素含量最低，葉綠素a含量為0.781 mg·g-1，葉綠素b含量為2.103 mg·g-1，類胡蘿卜素含量為 0.462 mg·g-1；以美國山核桃為砧木的嫁接苗居中，葉綠素a含量為 1.251 mg·g-1，葉綠素 b 含量為 3.383 mg·g-1，類胡蘿卜素含量為0.954 mg·g-1。通過多重比較可知，三種不同類型的砧木嫁接苗葉綠素含量差異顯著。

圖2 不同砧木山核桃嫁接苗光合色素含量Figure2 Changes of photosynthetic pigments content in graftedseedling ondifferent rootstocks

2.6 不同砧木類型的山核桃嫁接苗連接部位解剖比較

觀察三種嫁接苗嫁接部位形成層形成情況可發(fā)現(xiàn)（圖3），圖中A，B能在砧木和接穗的連接處觀察到向外隆起的再生組織，表明以美國山核桃和湖南山核桃為砧木的嫁接苗愈合情況較好，而C沒有隆起的跡象，甚至還有一些縫隙，說明山核桃本砧嫁接苗砧木和接穗愈合狀況不佳。通過對嫁接部位切片顯微觀察結(jié)果可知，三種嫁接苗在單位面積導(dǎo)管數(shù)量上存在顯著差異，其中以美國山核桃為砧木的嫁接苗導(dǎo)管數(shù)為94.8，以湖南山核桃為砧木的嫁接苗導(dǎo)管數(shù)為124.8，山核桃本砧嫁接苗導(dǎo)管數(shù)為62.0。而導(dǎo)管是植物體由根部向上運(yùn)輸水分和無機(jī)鹽的通道，因此其數(shù)量可以在一定程度上反映砧穗愈合的情況，數(shù)量越多其愈合情況越好。從D，E，F(xiàn)中可以看出，D導(dǎo)管較為集中的分布于木質(zhì)部外緣，E中導(dǎo)管分布較均勻，而F則完全沿木質(zhì)部分布，且數(shù)量極少，由此可知，砧穗愈合程度為以湖南山核桃為砧木的嫁接苗最好，山核桃本砧嫁接苗最差。

圖3 不同砧木山核桃嫁接苗砧穗結(jié)合部形態(tài)圖Figure3 the pattern of the joint of anvil ears of grafted seeding on different rootstocks

3 討論

嫁接成活實(shí)質(zhì)上就是砧穗愈合的過程[12]，砧穗之間的親和力是嫁接成活的基礎(chǔ)[13-14]，受其遺傳特性、生理機(jī)能、內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的相似性和相互適應(yīng)能力的影響[15]。嫁接成功的關(guān)鍵不僅取決于砧木和接穗品種的選擇，而且還取決于嫁接后砧木與接穗在生理上能否成為統(tǒng)一單位、能否無阻遏地相互進(jìn)行物質(zhì)交流，原來接穗不存在的物質(zhì)可由砧木運(yùn)到接穗，反過來接穗也可改變砧木內(nèi)含物的組成，從而影響到雙方形態(tài)和生理性狀發(fā)生變化[16]。戴佳麗等[17]通過對核桃夏季方塊芽接愈合過程嫁接面變化，得出愈合過程可劃分為4個(gè)階段：隔離層形成，愈傷組織形成，愈傷組織分裂增殖、抱合、連接，形成層恢復(fù)、輸導(dǎo)組織的形成。連接后的形成層進(jìn)行旺盛的細(xì)胞分裂，在砧穗接口處表現(xiàn)為顯著的偏向加粗生長，促進(jìn)砧穗間的結(jié)合[18]。即本研究中的向外隆起的再生組織，其中以湖南山核桃為砧木的嫁接苗偏向加粗生長最明顯，表明其砧穗愈合狀況較好，而山核桃本砧嫁接苗在砧穗接口處肉眼幾乎觀察不到偏向加粗生長，說明其砧穗愈合狀況較差，這可能是其成活率低的原因之一。黃堅(jiān)欽等[19]通過對山核桃嫁接愈合過程的解剖學(xué)觀察得出，山核桃嫁接成活率低的主要原因是由于山核桃形成層很薄，在休眠期僅3層左右，在嫁接時(shí)很難實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確對接，從而導(dǎo)致嫁接苗難以成活。這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的山核桃本砧嫁接苗砧穗愈合差，嫁接口處偏向加粗生長不明顯結(jié)論相一致。雖然本砧嫁接苗在形成層對接不準(zhǔn)、砧穗愈合狀況較差的情況下愈傷組織也能形成，但是此時(shí)形成的愈傷組織遠(yuǎn)沒有以湖南山核桃和美國山核桃形成的愈傷組織牢固，在做嫁接處切片的時(shí)候一切就碎。因此山核桃本砧嫁接苗雖然在嫁接早期表現(xiàn)出存活現(xiàn)象，但是由于砧穗沒有完全對接，嫁接苗也會因生長后期得不到水分和養(yǎng)料的供應(yīng)而死亡。而湖南山核桃和美國山核桃接穗形成層相對山核桃接穗而言厚一些，對形成層的對接準(zhǔn)確性要求較低，成活率自然就高了。

通常，成功的嫁接必須有砧穗疏導(dǎo)組織的相互連接，而連接是由被切斷的導(dǎo)管和篩管所產(chǎn)生的某種物質(zhì)引起，即由新的形成層或者導(dǎo)管和篩管原基細(xì)胞，進(jìn)一步分化出新的導(dǎo)管和篩管，成為連接砧穗雙方疏導(dǎo)組織系統(tǒng)的中間導(dǎo)管和篩管[16]。祖容等[20]研究認(rèn)為導(dǎo)管總面積與木質(zhì)部橫截面積的比值對新梢生長量起決定性作用。張玉蘭等[21]研究結(jié)果顯示山楂枝條的導(dǎo)管密度、導(dǎo)管占木質(zhì)部的百分比與植株生長勢之間有顯著的相關(guān)性。王宏偉等[22]發(fā)現(xiàn)枝條和根系導(dǎo)管總面積占木質(zhì)部總面積的比值，枝條導(dǎo)管密度均與甜櫻桃砧木的生長勢呈正相關(guān)。由此可見，導(dǎo)管作為植物體水分及礦質(zhì)營養(yǎng)運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?，其?shù)量的多少，導(dǎo)管橫截面積大小及其與木質(zhì)部橫截面積的比值等，都會對嫁接苗生長勢產(chǎn)生一定影響。通過對山核桃嫁接苗砧穗連接處切片圖發(fā)現(xiàn)，以湖南山核桃為砧木的嫁接苗在砧穗連接處再生組織中的導(dǎo)管數(shù)量明顯多于其余二者。結(jié)合不同砧木嫁接苗生長量情況可以說明，本砧嫁接苗砧穗愈合狀況差，并且在砧穗愈合后期不能再生足夠的導(dǎo)管以維持正常的生命活動，在整個(gè)植物體上表現(xiàn)為生長量小，新梢高度和節(jié)間長度遠(yuǎn)不如其余兩種類型嫁接苗。而以美國山核桃和以湖南山核桃為砧木的嫁接苗砧穗連接處愈合較好，導(dǎo)管數(shù)目較多，故其成活率較高，并且植株生長勢好。這與唐藝荃等[23]得出的山核桃和湖南山核桃親和性良好，且以湖南山核桃為砧木時(shí)，能促進(jìn)山核桃成活率和接穗粗度的結(jié)論相一致。

郭從儉等[24]研究證明，葉的大小是一項(xiàng)可以遺傳的性狀，并把葉面積作為作物高光效功能鑒定與篩選的基本要素。丁璇等[25]研究發(fā)現(xiàn)砧木對樹體礦質(zhì)營養(yǎng)代謝的過程有重要影響，進(jìn)一步對樹體的其它生理代謝活動產(chǎn)生影響，導(dǎo)致樹體在生長結(jié)果過程中產(chǎn)生變化，如樹形的差異等。陳忠杰等[26]通過研究發(fā)現(xiàn)不同砧木通過對營養(yǎng)的吸收來影響接穗的營養(yǎng)狀況進(jìn)而起到控制樹體大小的效應(yīng)。王麗榮等[27]通過在八棱海棠Malus robusta上嫁接紅富士M.pumila，表明砧木對接穗的短枝比率、萌芽率、成枝率都有影響。本次實(shí)驗(yàn)的三種類型嫁接苗接穗都是山核桃，只有砧木不同，但是各種類型嫁接苗在成熟葉片大小上表現(xiàn)出顯著差異，說明葉片大小受到砧木的影響，而以湖南山核桃和美國山核桃做砧木時(shí)，其葉片形態(tài)顯著大于山核桃本砧嫁接苗，表明其對山核桃接穗的葉片生長有促進(jìn)作用。

本研究觀察了三種嫁接苗嫁接部位形成層，以期探究山核桃本砧嫁接不如異砧嫁接的原因，為解釋砧穗間相互影響機(jī)制提供新的角度。

4 結(jié)論

不同砧木（山核桃、美國山核桃、湖南山核桃）對山核桃嫁接成活率及嫁接成活植株生長的影響差異極顯著。無論從成活率還是嫁接成活植株接穗的生長量來看，湖南山核桃異砧類型均優(yōu)于美國山核桃異砧類型和山核桃本砧類型；三種砧穗組合嫁接苗在光合色素含量上差異極顯著，湖南山核桃異砧類型含量最高，在一定程度上說明光合能力最強(qiáng)；湖南山核桃和美國山核桃為砧木的嫁接苗砧穗連接處偏向加粗生長情況明顯，砧穗愈合較好，而且其再生組織具有較多的導(dǎo)管數(shù)量，能輸送充足的無機(jī)鹽和水分維持植物體的生長，是其植株成活率高的原因。