張 琪，李白坤，朱繼民，劉竹青，蘇婧婧，李慶林

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230038)

藥物流產(chǎn)后沖任虛損，形體多虛多瘀，惡露排出不凈，瘀阻沖任，瘀血停積，阻礙新血?dú)w經(jīng)?；谥嗅t(yī)“瘀血不去、新血不生”治則，對產(chǎn)后血瘀證可用祛瘀生新法進(jìn)行治療。許多研究已證實(shí)，桃紅四物湯對于婦科血瘀證療效顯著[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，流產(chǎn)后子宮內(nèi)膜修復(fù)是減少產(chǎn)后子宮出血的重要環(huán)節(jié)，而子宮修復(fù)與子宮內(nèi)膜血瘀狀態(tài)改善和子宮內(nèi)膜血管新生密切相關(guān)[3]。內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，其與一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)皆可通過影響血管內(nèi)皮的舒縮功能進(jìn)而影響血瘀狀態(tài)[4-5]。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是NOS的一種亞型。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有顯著的誘導(dǎo)血管新生作用，與子宮內(nèi)膜修復(fù)有關(guān)[6]；血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)主要分布于血管內(nèi)皮表面，是可與VEGF進(jìn)行特異性結(jié)合的高親和力受體，調(diào)節(jié)血管的生成。本研究旨在通過動物實(shí)驗(yàn)，觀察桃紅四物湯對產(chǎn)后血瘀子宮的修復(fù)作用，探討其與ET-1、iNOS、VEGF和VEGFR-2的關(guān)聯(lián)性，為桃紅四物湯的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康SD大鼠100只，其中雌性70只、雄性30只，鼠齡10周，體質(zhì)量220～250 g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2013-0006]提供，常規(guī)飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 藥物 ①桃紅四物湯提取液的制備：桃紅四物湯(桃仁、當(dāng)歸、白芍各9 g，紅花、川芎各6 g，熟地黃12 g)藥材購自合肥樂家老鋪中藥飲片有限公司，加入10倍量(容積與質(zhì)量比)75%乙醇冷凝回流提取2 h后，倒出藥液，然后再用8倍量75%乙醇冷凝回流提取2 h，合并2次提取液，濃縮至含生藥含量為1.8 g/mL的提取液[7]。②益母草顆粒(國藥準(zhǔn)字Z45021652，批號170107)購自廣西禪方藥業(yè)有限公司；米非司酮片(國藥準(zhǔn)字H20033551，批號151201)購自湖北葛店人福藥業(yè)有限公司；米索前列醇(國藥準(zhǔn)字H20000668，批號43160403)購自華潤紫竹藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑與主要儀器 iNOS、ET-1及VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(批號均為201709)：上海碧云天生物科技有限公司；VEGFR-2抗體(批號ATQAU2306)：Abbkine公司；鼠抗(批號17042104)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ELX800uv酶標(biāo)儀：Bio-TEK公司；CK2型倒置顯微鏡：日本Olympus公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制與給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)留取8只雌性大鼠作為正常對照組，取雌鼠60只、雄鼠30只，于20：00以2∶1將其合籠，次日6：00進(jìn)行陰道栓和陰道涂片鏡檢，以發(fā)現(xiàn)陰道栓和精子的當(dāng)天為妊娠第1天。于妊娠第7天分別灌胃米非司酮(8.3 mg/kg，8：00)和米索前列醇(0.1 mg/kg，18:00)，給藥米索前列醇后向鼠陰道塞入適合大小的棉球。次日8：00和20：00取出棉球，若觀察到棉球上有血?jiǎng)t判為早孕大鼠藥物流產(chǎn)[8]。大鼠流產(chǎn)第2天從眼內(nèi)眥取血，肝素抗凝后，檢測血液流變學(xué)指標(biāo)變化；若全血黏度在低切(1 s-1)≥45 mPa·s、高切(200 s-1)≥4.5 mPa·s則為血液流變性異常，按照文獻(xiàn)[3]方法判斷產(chǎn)后血瘀模型是否復(fù)制成功。選取模型復(fù)制成功的大鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，即桃紅四物湯高劑量(18.0 g/kg)、中劑量(9.0 g/kg)、低劑量(4.5 g/kg，相當(dāng)于成人臨床用量的5倍)組，陽性對照組(益母草顆粒4.3 g/kg)和模型組(蒸餾水)；正常對照組給予蒸餾水。自由飲食，采用灌胃方式給藥(10 mL/kg)，每日2次，連續(xù)7 d。

2.2 指標(biāo)觀察方法

2.2.1 子宮形態(tài)觀察與VEGFR-2檢測 末次給藥1 h后，用3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取出大鼠子宮組織拍照后用10%甲醛固定，經(jīng)過石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，觀察大鼠的子宮形態(tài)學(xué)改變；然后按免疫組織化學(xué)試劑盒的要求，對切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，借助顯微鏡觀察大鼠子宮VEGFR-2的表達(dá)情況。

2.2.2 血清指標(biāo)檢測 采集子宮組織的同時(shí)，腹主動脈取血，離心后吸取血清，采用ELISA試劑盒，借助ELX800uv酶標(biāo)儀檢測iNOS、ET-1及VEGF水平。

3 結(jié)果

3.1 桃紅四物湯對大鼠子宮形態(tài)的影響 各組大鼠子宮的大體形態(tài)見文獻(xiàn)[9]。與正常對照組比較，模型組大鼠子宮色澤較暗，有水腫感，各給藥組大鼠子宮的色澤較模型組紅潤。HE染色后鏡下觀察子宮形態(tài)，發(fā)現(xiàn)正常對照組大鼠子宮內(nèi)膜腺體較大，間質(zhì)無水腫，無充血，管腔內(nèi)無紅細(xì)胞聚集；模型組大鼠子宮內(nèi)膜腺體較小，間質(zhì)稍顯水腫，有充血，管腔內(nèi)有紅細(xì)胞聚集；各治療組大鼠子宮內(nèi)膜充血和水腫等血瘀表現(xiàn)較模型組好轉(zhuǎn)。見圖1。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.桃紅四物湯低劑量組；D.桃紅四物湯中劑量組；E.桃紅四物湯高劑量組；F.陽性對照組

圖1各組大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化比較(HE染色，10×10倍)

3.2 桃紅四物湯對大鼠子宮VEGFR-2表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)染色后，子宮內(nèi)膜中血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的VEGFR-2被染成棕黃色；鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常對照組的棕黃色顆粒明顯多于模型組，各劑量組的棕黃色顆粒較模型組明顯增多。見圖2。

3.3 桃紅四物湯對大鼠血清VEGF、ET-1及iNOS水平的影響 模型組VEGF及iNOS均低于正常對照組(VEGF：t=9.587，P=0.000；iNOS：t=5.814，P=0.000)，但模型組ET-1高于正常對照組(t=-6.465，P=0.000)；各給藥組VEGF、iNOS及ET-1水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[VEGF：F(4，35)=55.774，P=0.000；iNOS：F(4，35)=7.726，P=0.000；ET-1：F(4，35)=11.304，P=0.000]，且與模型組相比，桃紅四物湯中劑量、高劑量組和陽性對照組VEGF及ET-1水平均明顯升高(P<0.05)，而iNOS水平則相對降低(P<0.05)，但桃紅四物湯低劑量組與模型組iNOS及ET-1水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.桃紅四物湯低劑量組；D.桃紅四物湯中劑量組；E.桃紅四物湯高劑量組；F.陽性對照組

圖2各組大鼠子宮組織VEGFR-2表達(dá)水平比較(免疫組織化學(xué)染色，10×20倍)

4 討論

桃紅四物湯能顯著改善產(chǎn)后血瘀狀態(tài)已為眾多臨床觀察和動物實(shí)驗(yàn)[3,10-11]證實(shí)，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)NO、ET-1、VEGF、Ang-1、Ang-2等物質(zhì)的表達(dá)水平有關(guān)[3,10,12-13]。但桃紅四物湯改善產(chǎn)后血瘀的作用是否與iNOS及VEGFR-2的表達(dá)水平有關(guān)尚未見報(bào)道。

本研究將VEGF與VEGFR-2組合，考察桃紅四物湯改善產(chǎn)后血瘀的作用是否與促進(jìn)血管新生有關(guān)；將ET-1與iNOS組合，考察桃紅四物湯改善產(chǎn)后血瘀狀態(tài)是否與調(diào)節(jié)血管舒縮功能有關(guān)；從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的角度初步探討桃紅四物湯對產(chǎn)后血瘀子宮的修復(fù)作用，并從血管舒縮功能調(diào)節(jié)及血管新生的角度分析該復(fù)方促進(jìn)血瘀子宮修復(fù)的可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯具有顯著促進(jìn)產(chǎn)后血瘀證大鼠子宮修復(fù)的作用，且該作用可能與桃紅四物湯下調(diào)血清ET-1的水平，上調(diào)iNOS水平，進(jìn)而直接減弱血管收縮功能，間接增強(qiáng)血管舒張功能[8]，以及上調(diào)VEGF及VEGFR-2而發(fā)揮促進(jìn)血管新生有關(guān)，結(jié)果與同類研究類似[3,12-13]。

表1 各組大鼠血清VEGF、ET-1及iNOS水平比較

注：與正常對照組比較；*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

桃紅四物湯源自清代吳謙等所著的《醫(yī)宗金鑒》，是中醫(yī)經(jīng)典名方，由桃仁、當(dāng)歸、白芍、紅花、川芎、熟地黃6味中藥組成。桃仁、紅花入血分，活血化瘀；川芎行血中之氣，行血活血；當(dāng)歸活血補(bǔ)血；白芍養(yǎng)血柔肝，緩急止痛；熟地黃補(bǔ)血滋陰。諸藥合用，有活血化瘀、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之效。本研究提示，桃紅四物湯促進(jìn)產(chǎn)后血瘀大鼠子宮修復(fù)的作用可能與血清iNOS的水平及子宮組織VEGFR-2的表達(dá)水平有關(guān)，為進(jìn)一步闡明桃紅四物湯的祛瘀生新作用機(jī)制提供參考。