謝云浩，王彥平，王相國(guó)，倪和民，麻柱**，郭勇，付博凡，楊佐君**

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 北京 102206；2.北京奶牛中心 北京 100020）

整合素αvβ3 是一種異二聚體的跨膜糖蛋白，可表達(dá)于多種細(xì)胞類型，分布較廣泛[1]，主要功能是結(jié)合配體，介導(dǎo)細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外間質(zhì)之間的相互作用，包括細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、血液凝集、腫瘤血管生成等過(guò)程。相關(guān)研究證明，整合素αvβ3 在胚胎著床過(guò)程中對(duì)子宮內(nèi)膜容受態(tài)的建立有著積極作用[2]。之前有學(xué)者提出在人的臨床中整合素αvβ3 與其配體的檢測(cè)可對(duì)子宮的容受態(tài)和非容受態(tài)進(jìn)行鑒別[3-5]。近年來(lái)在牛、羊、豬等動(dòng)物的早期妊娠研究中也檢測(cè)到了整合素對(duì)子宮容受態(tài)建立的積極意義[6,7]。子宮容受態(tài)的建立與否是妊娠成功的重要影響因素，妊娠失敗多發(fā)生在該階段[8-10]，因此在該階段進(jìn)行妊娠成功的檢測(cè)十分有意義。

目前，奶牛妊娠檢測(cè)常用直腸觸診法、超聲波檢查法等臨床診斷法和孕酮、早期妊娠因子等免疫診斷方法[11]。以上檢測(cè)方法在檢測(cè)對(duì)象、檢測(cè)成本、操作難度和對(duì)檢測(cè)對(duì)象的傷害等方面表現(xiàn)優(yōu)劣各異，但最早準(zhǔn)確檢測(cè)的窗口時(shí)間為輸精后的第28d[12,13]。牛胚胎著床過(guò)程中子宮容受態(tài)建立發(fā)生在輸精后第10～20d，整合素αvβ3 有可能在這段時(shí)間發(fā)生mRNA 水平表達(dá)量的變化[14,15]。如果將受孕率與整合素αvβ3 在mRNA 水平的表達(dá)量建立聯(lián)系，有可能把奶牛早期妊娠的檢測(cè)窗口提前到第10～20d。通過(guò)血液中整合素αvβ3 的表達(dá)變化檢測(cè)早期妊娠結(jié)果可以提前對(duì)妊娠奶牛進(jìn)行必要的保胎措施[16]，對(duì)未受孕的奶牛采取二次輸精，或?qū)遗洳辉心膛Ｌ蕴?，降低飼養(yǎng)與護(hù)理成本[17]，因此早孕檢測(cè)窗口期提前是提高配種效率的有效手段[14]。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器設(shè)備 熒光定量PCR 儀：Eppendorf，AG 22331 hanburg；電熱恒溫干燥箱：上海一恒科技儀器有限公司，DHG-9075A；低溫離心機(jī)：Backman Coultek，AllegraTM64R Centrifuge；微量紫外分光檢測(cè)系統(tǒng)：Alphaspec Innotech,Alpha SpecTM；手掌離心機(jī)：Bratt；制膠架：北京百晶生物技術(shù)有限公司；震蕩恒溫箱：中國(guó)哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，HZQ-X100；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)BIO-RAD 公司；-80℃超低溫冰箱：日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；電泳儀電源：北京百晶生物技術(shù)有限公司，power 600i；電熱恒溫水槽：上海森信實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DK-8D 型。

1.1.2 試 驗(yàn) 試 劑 TRLzol?Reagent 總RNA 提 取 試 劑：Invitrogen USA LTD，200mL/ 瓶；M-MLV RT5×Buffer：PromegaBiotech (Beijing) Co.；dNTP Mixture：TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co.，2.5mmol each；UltraSYBR Mixture (High ROX)：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，5mL/盒；DEPC Treated Water (RNase Free)：TaKaRa Biotechnology(Dalian) Co.；PVDF 膜：Millipper 公司；甲叉雙丙烯酰胺：美國(guó)SAN LAND 公司；5×蛋白上樣緩沖液：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；過(guò)硫酸銨、Tween-20、SDS：北京定國(guó)生物有限公司；全血總蛋白提取試劑盒：上海貝博生物科技有限公司，BB-319617；β-actin、αv、β3 一抗，二抗：北京嘉暄智瑞生物科技有限公司。

1.2 樣品選取與采血方法

北京地區(qū)某標(biāo)準(zhǔn)化奶牛場(chǎng)，選取10 頭荷斯坦雌性奶牛。這些牛要求為：2016 年出生，體重相似，本次受孕均為第二胎，無(wú)生殖疾病及其他疾病，使用同期發(fā)情技術(shù)，確保輸精日期為同一天，并在輸精后繼續(xù)跟蹤觀察奶牛的受孕情況。

使用5mL 注射器并更換9 號(hào)針頭，牛尾根部10cm 凹陷處采血，注射入抗凝管中備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)與處理

通過(guò)NCBI 查找相關(guān)基因的CDs 序列，并通過(guò)primer 3.0對(duì)引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，隨后引物通過(guò)BLAST 系統(tǒng)和前期實(shí)驗(yàn)證明引物的特異性和擴(kuò)增效率符合試驗(yàn)要求，并確定引物。確定后將引物序列交予生工生物工程（上海）股份有限公司由其代為合成，具體信息見(jiàn)表1。

將原裝引物進(jìn)行3,000r/min 離心1min，按照說(shuō)明添加ddH2O，確保最終摩爾濃度為25μmol/mL，震蕩混勻后進(jìn)行分裝，常用4℃保存，備用-20℃保存。

1.4 Trizol 法提取RNA 與反轉(zhuǎn)錄

勻漿處理：取1mL 凍存牛全血加入3mL 紅細(xì)胞裂解液靜置10min，10,000r/min 離心1min 收集白細(xì)胞沉淀。分層：加入500μL Trizol 后室溫靜置5min，加入200μL 氯仿劇烈震蕩后靜置3min。RNA 沉淀：4℃ 12,000r/min 離心10min 后，將400μL轉(zhuǎn)移水相加入400μL 冰乙醇室溫10min，4℃ 12,000r/min 離心10min 棄上清，RNA 沉淀于管底。RNA 漂洗：RNA 沉淀中加入75%乙醇溫和震蕩，4℃ 6,000r/min 離心1min，吸棄上清室溫晾干。溶解RNA：加入50μL RNase-free water 輕彈管壁充分溶解RNA。測(cè)定RNA 質(zhì)量濃度：設(shè)置微量紫外分光檢測(cè)系統(tǒng)OD 比值為260/280，單位μg/μL 進(jìn)行質(zhì)量濃度測(cè)定。合成cDNA：分別加入1μg 體積的RNA、1μL Oligo d(T)18 Primer、4μL M-MLV RT 5×Buffer、2μL dNTP Mixture、1μL M-MLV Reverse Transcriptase、1μL Recombinant Rnase Inhibitor (RRI)，最終使用DEPC Treated Water 加至20μL。

1.5 熒光定量PCR

下載Step one 2.3 軟件并正確安裝。將引物原液使用ddH2O 進(jìn)行稀釋。PCR 使用50μL 反應(yīng)體系，25μL 2×UltraSYBR Mixture(High ROX)、1μL Forward Primer，10HM、1μL Reverse Primer，10HM、2μL Template DNA、ddH2O 加至50μL。加樣完成使用手掌離心機(jī)離心15s 確保管壁無(wú)液滴，液面下無(wú)氣泡。提前15min 打開(kāi)熒光定量PCR 儀進(jìn)行預(yù)熱。PCR 反應(yīng)程序設(shè)定：預(yù)變性95℃ 10min，變性、退火、延伸分別為95℃ 10s、59℃ 30s、72℃ 32s，并循環(huán)40 次，第三階段95℃ 15s、60℃ 1min、95℃15s、60℃ 15s。拷貝數(shù)據(jù)，進(jìn)行處理。

1.6 Western blot

1.6.1 提取血漿蛋白每500μL 蛋白提取液加入2μL 蛋白酶抑制劑混合物和2μL 蛋白穩(wěn)定劑，混合后置于冰上備用；取300μL 全血樣品，加入300μL 蛋白提取液，充分混勻后，在4℃條件下震蕩10min；將離心柱內(nèi)柱套上套管，將提取液吸入離心柱內(nèi)，在4℃條件下10000r/min 離心4min；收集套管內(nèi)液體及全血總蛋白，可-80℃保存；將所得總蛋白使用ddH2O 稀釋100 倍。

表1 引物序列

1.6.2 BCA 蛋白濃度測(cè)定 配工作液，試劑A:試劑B=50:1；待測(cè)蛋白每孔加10μL 和200μL BCA 工作液，做3 組平行；37℃培養(yǎng)30min；使用酶標(biāo)儀在562nm 波長(zhǎng)處測(cè)定；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算濃度值；使用1×蛋白上樣緩沖液調(diào)平。

1.6.3 Western blot 分析 配制SDS-PAGE 分離膠，沿邊加入，用水壓平，凝固后將水倒出，濾紙吸干；配制SDS-PAGE 濃縮膠，插入梳子，用槍加滿，凝固后放入電泳槽，添加電泳液，4℃靜置過(guò)夜；加樣，兩端buffer，左側(cè)Marker，每孔加入30μL，濃縮膠100V 20min，分離膠150V 40min；轉(zhuǎn)膜，將PVDF 膜甲醛浸泡10min，以黑板-海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿-白板對(duì)應(yīng)放好避免氣泡，250mA 2h；封閉，將PVDF 膜浸于5%脫脂牛奶的PBST 溶液中，搖床40r/min 2h；一抗0.4μg/mL 孵育，PBST 浸泡3 次，每次搖床40r/min 5min，裁剪PVDF 膜一抗4℃過(guò)夜；二抗0.4μg/mL 孵育，PBST 浸泡3 次，每次搖床40r/min 5min，二抗搖床40r/min 孵育2h；HRP-ECL 發(fā)光鑒定，PBST浸泡4 次，每次搖床40r/min 10min，避光添加ECL 至于蛋白曝光儀；拷取數(shù)據(jù)，進(jìn)行處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2017 和SPSS 22.0 等軟件進(jìn)行處理。試驗(yàn)結(jié)果使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，使用t 檢驗(yàn)差異顯著性分析的方法，*表示兩組數(shù)據(jù)間差異顯著，**為差異極顯著（P ＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 奶牛受孕檢測(cè)結(jié)果

在輸精后第40d 使用直腸觸診法進(jìn)行受孕檢測(cè)，所選取的10 頭荷斯坦奶牛7 頭受孕，3 頭未受孕。

2.2 受孕奶牛血液αv 基因相對(duì)表達(dá)量

αv 基因在受孕奶牛中表達(dá)結(jié)果如圖1 所示。結(jié)果顯示在輸精后的第13 和16d 時(shí)αv 基因表達(dá)量同比第10d 明顯升高，同時(shí)第16天表達(dá)量更高，而第19天時(shí)有較明顯降低，但仍有所表達(dá)。

2.3 未受孕奶牛血液αv 基因相對(duì)表達(dá)量

αv 基因在未受孕奶牛中表達(dá)結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果顯示同比第10d，第13d αv 基因表達(dá)量無(wú)增加趨勢(shì)，第16 和19d αv基因表達(dá)量同比第10d 明顯下降。

2.4 受孕奶牛血液β3 基因相對(duì)表達(dá)量

β3 基因在受孕奶牛中表達(dá)結(jié)果如圖3 所示，結(jié)果顯示在輸精后的第13、16 和19d 時(shí)β3 基因表達(dá)量同比第10d 明顯升高，同時(shí)第16d 表達(dá)量最高，雖然第19d 呈下降趨勢(shì)，但β3 基因表達(dá)量仍高于輸精后第10d。

2.5 未受孕奶牛血液 β3 基因相對(duì)表達(dá)量

β3 基因在未受孕奶牛中表達(dá)結(jié)果如圖4 所示。結(jié)果顯示在輸精后的第13d 時(shí)β3 基因表達(dá)量同比第10d 明顯升高，第16d表達(dá)量迅速減少并明顯低于第10d，雖然第19d 有所回升，但β3 基因表達(dá)量仍低于輸精后第10d。

2.6 αv 與β3 蛋白在受孕與未受孕奶牛中的表達(dá)差異

αv 與β3 在蛋白質(zhì)表達(dá)水平WB 檢測(cè)結(jié)果如圖5 所示。顯示

在受孕奶牛血漿中輸精后第16d 時(shí)αv 與β3 蛋白質(zhì)表達(dá)相比較明顯升高，而未受孕奶牛血漿中的αv 與β3 蛋白質(zhì)表達(dá)在輸精后。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，輸精后第16d 時(shí)αv 基因和β3 基因表達(dá)量與奶牛受孕結(jié)果相關(guān)，即高表達(dá)量的奶牛在后期統(tǒng)計(jì)中顯示為受孕奶牛，而低表達(dá)量奶牛在后期的統(tǒng)計(jì)中顯示為未受孕奶牛。在觀察受孕奶牛αv 基因和β3 基因表達(dá)量變化中發(fā)現(xiàn)，受孕奶牛在輸精后第10、13 和16d 呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，αv 基因相對(duì)溫和，而β3 基因升高較快，第19d 時(shí)αv 基因和β3 基因表達(dá)量均快速下降；未受孕奶牛的αv 基因和β3 基因表達(dá)量在輸精后第13d同比受孕奶牛的表達(dá)量增加緩慢或者不增加，第16d 時(shí)更是出現(xiàn)顯著降低，且遠(yuǎn)低于第10d，第19d 有所回升但回升不明顯。通過(guò)Western blot 試驗(yàn)得出αv 與β3 在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)趨勢(shì)基本與其在mRNA 水平一致；此結(jié)果與Chisei Tei 等在人整合素αvβ3 表達(dá)量與受孕結(jié)果關(guān)系的研究結(jié)果相似[18]。本試驗(yàn)結(jié)果可初步證明荷斯坦奶牛在受孕過(guò)程中整合素αvβ3發(fā)揮著重要作用，是影響早期妊娠的重要因子，輸精后第16d 其mRNA 表達(dá)水平與受孕結(jié)果相關(guān)。

本試驗(yàn)因受樣本采集量、取樣時(shí)間間隔、奶牛品種及養(yǎng)殖環(huán)境差異等因素影響可能存在一定的局限性[19,20]，將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步完善。為有效避免其他影響早期妊娠的不利因素加強(qiáng)變量控制，試驗(yàn)所選用的奶牛均為受孕第二胎次，因此本研究結(jié)果是否適用于其它胎次還有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步證明。

目前奶牛業(yè)妊娠檢測(cè)常用檢查法的最早檢測(cè)窗口在輸精后第28d[21]。本試驗(yàn)的目的是希望建立αvβ3 在mRNA 表達(dá)水平與受孕結(jié)果之間的聯(lián)系，篩選出可檢測(cè)的早期妊娠關(guān)聯(lián)因子，為奶牛懷孕檢測(cè)窗口期的提前提供理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)結(jié)果將有可能使荷斯坦奶牛的妊娠檢測(cè)窗口期提前到輸精后的第16d，如應(yīng)用于生產(chǎn)將有效降低繁殖成本，提高奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。