李曉娜，宋一菲，史佩佩，宋 婕，陳維毅，賀 瑞

(1.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原 030024；2.山西省眼科醫(yī)院 準(zhǔn)分子激光室，太原 030002)

圓錐角膜(keratoconus)是一種以角膜基質(zhì)變薄、失去正?；《榷l(fā)生錐形變形為特征的角膜擴(kuò)張性疾病，是眼科臨床常見的致盲疾病之一。其臨床表現(xiàn)為不規(guī)則散光和高度近視，視力嚴(yán)重受損，部分患者不得不接受角膜移植。目前圓錐角膜的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。一般認(rèn)為遺傳因素預(yù)先存在，環(huán)境因素(揉眼、佩戴角膜接觸鏡、紫外線損傷等)作為“誘因”誘發(fā)圓錐角膜的發(fā)生發(fā)展[1]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是細(xì)胞內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)的正常代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時(shí)，體內(nèi)活性氧生成累積過多，超出細(xì)胞清除能力，細(xì)胞氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，則導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。氧化應(yīng)激可引起炎癥介質(zhì)的過度釋放，過度或慢性炎癥刺激會(huì)引起組織蛋白酶表達(dá)增加，降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞組織結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，使組織穩(wěn)態(tài)失衡。對(duì)體外培養(yǎng)的圓錐角膜患者的角膜細(xì)胞[2-4]、角膜組織[5-6]及血清[7-8]的研究均提示氧化應(yīng)激在圓錐角膜病理過程中扮演了一定角色。自由基的持續(xù)產(chǎn)生能夠激活包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶促防御系統(tǒng)，使自由基維持在較低水平，防止細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。研究表明，圓錐角膜患者角膜基質(zhì)細(xì)胞抗氧化酶表達(dá)量明顯低于正常人，Nrf2-ARE信號(hào)通路活化缺陷與基質(zhì)降解酶表達(dá)增高密切相關(guān)[4]。此外，圓錐角膜上皮細(xì)胞可能存在細(xì)胞自噬障礙，而細(xì)胞自噬是細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激損傷的一個(gè)自我保護(hù)的防御反應(yīng)，被氧化應(yīng)激損傷的蛋白和細(xì)胞器如不能及時(shí)清除，則加重氧化應(yīng)激損傷[9]。

研究發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者淚液中或血清中的炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1/-4/-5/-6/-8/-17、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)等均顯著高于正常人群[10-13]。采用環(huán)孢素A可降低圓錐角膜患者淚液中TNF-α、IL-6和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9的表達(dá)，延緩圓錐角膜病情的進(jìn)展[14]。上述研究提示炎性因子參與了圓錐角膜的病理過程。

角膜是典型的承載組織，生物力學(xué)因素在圓錐角膜發(fā)病中的作用不可忽視。圓錐角膜局部組織變薄、結(jié)構(gòu)破壞、材料性能降低，將導(dǎo)致角膜內(nèi)部應(yīng)力發(fā)生重新分布。角膜變薄區(qū)域在眼內(nèi)壓的作用下容易發(fā)生應(yīng)力集中，導(dǎo)致材料疲勞失效。若患者伴有用力揉眼習(xí)慣，則可能進(jìn)一步改變角膜受力環(huán)境，如角膜粘度降低，眼壓瞬間升高等，這都將增加角膜發(fā)生更大形變的風(fēng)險(xiǎn)[15]。應(yīng)力與生長(zhǎng)、疾病之間關(guān)系密切[16]，研究表明力學(xué)因素在青光眼等眼科疾病中的發(fā)揮了重要作用[17-18]。前期研究發(fā)現(xiàn)，圓錐角膜成纖維細(xì)胞IL-6、TNF-α及MMPs表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞[19-20]，機(jī)械牽拉可促進(jìn)角膜成纖維細(xì)胞和MMPs表達(dá)，機(jī)械牽拉和炎癥介質(zhì)聯(lián)合作用可進(jìn)一步使MMPs表達(dá)上調(diào)[21-23]。力學(xué)刺激可介導(dǎo)心血管和肺組織等氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥介質(zhì)釋放，與動(dòng)脈粥樣硬化和呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷等疾病密切[24-25]。力學(xué)環(huán)境改變是否引起角膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子釋放，進(jìn)而導(dǎo)致角膜基質(zhì)降解、促進(jìn)圓錐角膜的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 主要試劑

改良Eagle(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium,DMEM)/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)、Ⅱ型膠原酶(美國(guó)Sigma公司)、TRIZOL及Prime-ScriptTMRT RNA 檢測(cè)試劑(寶生物工程(大連)有限公司)、酶聯(lián)免疫分析試劑盒(ELISA)(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(美國(guó)Sigma公司).

1.2 人角膜成纖維細(xì)胞的提取及培養(yǎng)

1例正常人(normal cornea,NC)及2例圓錐角膜患者角膜組織(keratoconic cornea,KC)取自山西省眼科醫(yī)院，均為角膜移植術(shù)后的廢棄組織。機(jī)械剝離角膜上皮和內(nèi)皮層，PBS溶液反復(fù)清洗后，用質(zhì)量濃度1 mg/mL Ⅱ型膠原酶的培養(yǎng)基消化，直至組織塊完全消失，鏡下可見單個(gè)細(xì)胞時(shí)終止消化。2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12，并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)采用3～5代的角膜細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞力學(xué)加載實(shí)驗(yàn)

采用柔性基底拉伸系統(tǒng)Flexcell 4000(美國(guó)Flexcell公司)對(duì)角膜成纖維細(xì)胞施加頻率0.1 Hz、幅度15%、時(shí)間12 h周期性機(jī)械牽拉載荷，以未加載的靜態(tài)培養(yǎng)為對(duì)照。

卸載后，收集條件培養(yǎng)基上清進(jìn)行蛋白檢測(cè)；PBS清洗細(xì)胞后，分別用TRIZOL裂解收集RNA或進(jìn)行熒光染色。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)檢測(cè)

PBS清洗細(xì)胞，加入適量濃度為10 μmol/L DCFH-DA工作液，37 ℃孵育30 min，其間每隔10 min晃動(dòng)一次，使探針充分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。PBS清洗，熒光倒置顯微鏡(IX-70，Olympus，日本)下進(jìn)行觀察、拍照。采用Image Pro Plus 5.2軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化，以平均光密度(optical density,OD)值來表示ROS水平的高低。

1.5 酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法測(cè)定炎性因子和MMP-9含量

BCA法測(cè)定條件培養(yǎng)基中的總蛋白含量，采用ELISA方法檢測(cè)條件培養(yǎng)基中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9的表達(dá)。ELISA試劑盒按說明書進(jìn)行操作檢測(cè)。采用酶標(biāo)儀(MULTISKIN GO,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)在450 nm精度波長(zhǎng)下測(cè)量OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得樣本蛋白含量。

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)抗氧化酶基因表達(dá)

收集細(xì)胞裂解液，提取總RNA，使用Prime-ScriptTMRT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(StepOne Plus，ABI，美國(guó))檢測(cè)SOD-2、HO-1、NQO-1的mRNA表達(dá)，并以管家基因GAPDH作為內(nèi)參。檢測(cè)基因的引物序列為：GAPDH上游序列為5′-GCACCGTCAAGGCTGA-

本試驗(yàn)采用黑龍江農(nóng)墾總局八五七農(nóng)場(chǎng)科技園的空育131等13種水稻品種，各品種均為移栽，田地條件、施肥量、田間管理等基本相似。種植時(shí)間為2010年5月15日-5月17日。由于當(dāng)年高溫，所有的水稻的主莖葉都比正常時(shí)的水稻少1片葉。各品種的名稱及水稻葉片數(shù)如表1所示。

GAAC-3′，下游序列為5′-TGGTGAAGACGCCAG-

TGGA-3′；SOD-2上游序列為5′-CCTAACGGTGGTGGAGAACC-3′，下游序列為5′-CTGAGCCTTGGACACCAACA-3′；HO-1上游序列為5′-CAG-

TGCCACCAAGTTCAAGC-3′，下游序列為5′-CTGGATGTTGAGCAGGAACG-3′；NQO-1上游序列為5′-AAGCCGCAGACCTTGTGATA-3′，下游序列為5′-TGGCAGCGTAAGTGTAAGCA-3.PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中的單因素方差分析法比較不同組間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 機(jī)械牽拉對(duì)角膜成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及抗氧化酶表達(dá)的影響

如圖1所示，靜態(tài)培養(yǎng)條件下，兩例KC細(xì)胞ROS 熒光強(qiáng)度明顯高于NC細(xì)胞，平均OD值分別是NC組的1.28倍和1.21倍(均P<0.05).周期性牽拉使NC和KC2細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度顯著增加，平均OD值分別是各自靜態(tài)培養(yǎng)組的1.25倍和1.45倍(均P<0.05)；KC1則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

如圖2所示，靜態(tài)培養(yǎng)條件下，與NC細(xì)胞比較，KC1細(xì)胞抗氧化酶基因表達(dá)水平均較低，SOD-2，HO-1，NQO-1分別為NC細(xì)胞的0.68倍(P>0.05)，0.29倍(P<0.05)，0.45倍(P<0.05)；而KC2細(xì)胞抗氧化酶的表達(dá)則均較高，SOD-2，HO-1，NQO-1分別為NC細(xì)胞的3.33倍(P<0.05)，1.85倍(P<0.05)，1.23倍(P>0.05).

周期性牽拉可顯著上調(diào)NC細(xì)胞HO-1和NQO-1基因表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量分別是靜態(tài)培養(yǎng)組的2.65倍和2.50倍(P<0.05)；SOD-2表達(dá)則無顯著變化(P>0.05).KC1與NC表達(dá)趨勢(shì)類似。KC2細(xì)胞表現(xiàn)則不同，周期性牽拉使SOD-2和HO-1基因相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，分別是靜態(tài)培養(yǎng)組的0.86倍和0.22倍(P<0.05)；NQO-1則未見顯著變化(P>0.05).

所有值均以NC靜態(tài)組比較；#P<0.05，靜態(tài)培養(yǎng)條件下KC組與NC組比較；*P<0.05，牽拉組與各自靜態(tài)對(duì)照比較圖1 周期性牽拉對(duì)正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細(xì)胞ROS水平的影響Fig.1 Effects of cyclic stretch on the ROS level in normal and keratoconic corneal fibroblasts

2.2 機(jī)械牽拉對(duì)角膜成纖維細(xì)胞炎性因子及MMP-9表達(dá)的影響

如圖3所示，靜態(tài)培養(yǎng)條件下，KC1和KC2細(xì)胞IL-6蛋白表達(dá)量均顯著高于NC細(xì)胞，分別為NC細(xì)胞的1.59倍和1.30倍(均P<0.05)；TNF-α蛋白表達(dá)與IL-6類似，KC1和KC2細(xì)胞的表達(dá)量分別為NC細(xì)胞的1.25倍和1.29倍(均P<0.05)； KC2細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)顯著高于NC細(xì)胞(P<0.05)，KC1細(xì)胞則無顯著變化(P>0.05).

周期性牽拉使NC、KC1、KC2細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)。與各自的靜態(tài)培養(yǎng)組比較，IL-1β分別增加了16%、4%和37%(均P<0.05)；IL-6分別增加了54%、5%和8%(均P<0.05)；TNF-α分別增加了43%、16%和20%(均P<0.05).

所有值均與NC靜態(tài)培養(yǎng)組比較；#P<0.05，靜態(tài)培養(yǎng)條件下KC組與NC組比較；*P<0.05，牽拉組與各自靜態(tài)對(duì)照比較圖2 周期性牽拉對(duì)正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細(xì)胞抗氧化酶SOD-2、HO-1和NQO-1基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of cyclic stretch on the gene expression of antioxidant enzymes SOD-2, HO-1 and NQO-1 in normal and keratoconic corneal fibroblasts

靜態(tài)培養(yǎng)條件下，KC1和KC2細(xì)胞MMP-9的蛋白表達(dá)均顯著高于NC細(xì)胞，分別是NC細(xì)胞的1.30倍和1.16倍(均P<0.05).周期性牽拉使NC細(xì)胞及KC2細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，與靜態(tài)培養(yǎng)組比較，分別增加了31%和17%(均P<0.05)；KC1細(xì)胞則無顯著變化(P>0.05).

3 討論

本文主要探索了力學(xué)刺激對(duì)正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎性因子及MMP-9表達(dá)的影響。角膜處于各種有應(yīng)激源的環(huán)境當(dāng)中，如接觸鏡的佩戴、紫外照射等。圓錐角膜患者不僅細(xì)胞內(nèi)存在較高水平的ROS[2-4]，角膜組織[5-6]甚至整個(gè)機(jī)體內(nèi)[7-8]氧化應(yīng)激水平也均偏高。力學(xué)刺激可通過氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)釋放參與動(dòng)脈粥樣硬化和肺損傷等病理過程[24-25]。本文的研究表明周期性牽拉也是角膜細(xì)胞一種產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎性因子的重要來源之一。

所有值均與NC靜態(tài)培養(yǎng)組比較；#P<0.05，靜態(tài)培養(yǎng)條件下KC組與NC組比較；*P<0.05，牽拉組與各自靜態(tài)對(duì)照比較圖3 周期性牽拉對(duì)正常人及圓錐角膜患者角膜成纖維細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α及MMP-9蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of cyclic mechanical strain on the protein expression of inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α and MMP-9 in normal and keratoconic corneal fibroblasts

本文研究發(fā)現(xiàn)KC細(xì)胞的ROS熒光強(qiáng)度明顯高于NC細(xì)胞，這與文獻(xiàn)[4]報(bào)道的結(jié)果一致，提示圓錐角膜成纖維細(xì)胞本身存在較高的氧化應(yīng)激水平?？寡趸赶到y(tǒng)可降低自由基水平，保護(hù)細(xì)胞防止發(fā)生氧化損傷。其中，HO-1可通過催化形成膽綠素、膽紅素、鐵離子來清除體內(nèi)的自由基，是維持氧化和抗氧化動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵因素，被認(rèn)為氧化應(yīng)激中一種高度敏感和可靠的指標(biāo)。SOD可使超氧陰離子發(fā)生歧化作用轉(zhuǎn)化為H2O2，再經(jīng)體內(nèi)過氧化氫酶和過氧化物酶的分解轉(zhuǎn)化為水和氧氣。NQO-1可借助NADH或NADPH作為電子供體，催化醌類物質(zhì)發(fā)生還原反應(yīng)，降解醌類及其衍生物，阻止其進(jìn)一步參與氧化還原反應(yīng)和ROS的產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)正常和圓錐角膜細(xì)胞SOD2、HO-1和NQO-1等3種抗氧化酶的表達(dá)呈現(xiàn)出多樣化。與NC細(xì)胞相比，KC1細(xì)胞的3種抗氧化酶基因表達(dá)水平均較低，其中HO-1、NQO-1顯著降低；而KC2細(xì)胞的3種抗氧化酶基因表達(dá)水平則均較高，其中SOD2，HO-1顯著增高。這可能與不同患者的病程、病因以及個(gè)體差異有關(guān)。周期性牽拉后NC和KC細(xì)胞均表現(xiàn)出ROS水平上調(diào)，正常細(xì)胞在受牽拉后能夠通過上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)清除ROS，雖然KC1在受到力學(xué)刺激后抗氧化酶表達(dá)也能上調(diào)，但因其靜態(tài)培養(yǎng)條件下本身抗氧化酶水平就較低，較小幅度的增加量不足以清除過量的自由基，同樣會(huì)引起氧化損傷。KC2細(xì)胞在牽拉后則表現(xiàn)為抗氧化酶表達(dá)顯著降低或無明顯變化，提示其抗氧化系統(tǒng)活化可能存在一定缺陷，且KC2細(xì)胞在受牽拉后ROS水平顯著高于NC和KC1細(xì)胞。圓錐角膜細(xì)胞的這兩種情況均可能導(dǎo)致超氧化物和過氧化氫等過度累積，使角膜細(xì)胞和組織容易受到氧化損傷。

臨床及體外實(shí)驗(yàn)研究提示炎癥介質(zhì)參與了圓錐角膜的發(fā)生發(fā)展過程。本研究發(fā)現(xiàn)圓錐角膜細(xì)胞的炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9的表達(dá)顯著高于正常人，這與文獻(xiàn)[10-14,19-20]報(bào)道一致。周期性牽拉使上述指標(biāo)進(jìn)一步上調(diào)。炎癥介質(zhì)可通過調(diào)節(jié)蛋白酶及其抑制劑等表達(dá)影響細(xì)胞外基質(zhì)的重塑。本研究的前期工作表明，TNF-α在促進(jìn)圓錐角膜成纖維細(xì)胞MMPs表達(dá)的同時(shí)顯著降低了TIMPs表達(dá)，導(dǎo)致二者表達(dá)失衡[19]；同時(shí)TNF-α還可以通過IL-6調(diào)節(jié)MMP-1表達(dá)[20]，使角膜基質(zhì)趨于降解；周期性牽拉與PGE2聯(lián)合作用可下調(diào)圓錐角膜細(xì)胞賴氨酰氧化酶家族基因表達(dá)，影響角膜膠原交聯(lián)[22]。這表明炎性因子可通過促進(jìn)MMPs表達(dá)，并使之與TIMPs失衡，或引起膠原蛋白交聯(lián)障礙，進(jìn)而造成角膜基質(zhì)降解、降低角膜組織力學(xué)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致圓錐角膜的發(fā)生或促進(jìn)角膜進(jìn)一步膨隆。

氧化應(yīng)激與炎癥之間可相互作用，互相促進(jìn)，共同加重組織損傷。一方面，氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙可以刺激炎癥反應(yīng)的發(fā)生, 并加重炎癥反應(yīng)。氧化應(yīng)激可以刺激角膜上皮細(xì)胞IL-6和MMP-9基因及蛋白表達(dá)，但使TIMP-1、COLIVA1和LOX表達(dá)下調(diào)，與圓錐角膜患者上皮表現(xiàn)類似[9]；另一方面，炎癥介質(zhì)在炎癥部位持續(xù)存在，又會(huì)激發(fā)慢性氧化應(yīng)激，降低細(xì)胞的抗氧化能力。研究表明IL-1α可下調(diào)圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞SOD3表達(dá)[28]。氧化應(yīng)激介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)調(diào)控途徑非常復(fù)雜，氧化應(yīng)激可通過激活炎性小體、Toll樣受體蛋白家族、NF-κB信號(hào)途徑或擾亂轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子抗氧化信號(hào)通路等機(jī)制介導(dǎo)炎性因子的釋放[29-30]。進(jìn)一步研究力學(xué)刺激引起的氧化應(yīng)激對(duì)炎性因子表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，將有助于深入了解圓錐角膜的發(fā)病機(jī)理，為臨床診治提供有價(jià)值參考。

本研究具有一定的局限性。首先，正常人及圓錐角膜患者角膜樣本數(shù)量有限(正常角膜1例，圓錐角膜2例)，且不同患者的病情有所不同；此外，體外力學(xué)刺激僅在一定程度上模擬角膜組織的在體環(huán)境，并不能代表角膜的真實(shí)受力情況。因此，結(jié)果解釋時(shí)仍需謹(jǐn)慎。

研究結(jié)果提示圓錐角膜的發(fā)生發(fā)展可能與氧化應(yīng)激及炎性因子表達(dá)上調(diào)有關(guān)，力學(xué)刺激可進(jìn)一步促進(jìn)炎性因子和蛋白酶表達(dá)，加速基質(zhì)降解。因此有效控制氧化應(yīng)激和炎性因子可能成為治療圓錐角膜的潛在靶點(diǎn)。