曾 紅，王蔭蔭，翟慧娟，賀 菲，鮑 潔,*

1塔里木大學(xué)新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，阿拉爾 843300；2濟南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，濟南 250022

海洋真菌資源豐富，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、豐富多樣的活性代謝產(chǎn)物，已經(jīng)成為藥用先導(dǎo)化合物的重要資源。深海作為海洋環(huán)境中的極端區(qū)域，約占海洋總體積的75%，雖然其環(huán)境惡劣，具有高壓、高鹽、低溫、低氧、低光照、營養(yǎng)貧瘠等特點，但是其微生物資源仍然非常豐富，在深海生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色[1]。深海真菌多樣性及其代謝產(chǎn)物的研究起步相對較晚，Roth等在1964年首次從大西洋4 450米沉積物中分離出深海真菌，直到2004年，Gautschi等才首次報道了從海洋沉積物來源的真菌中發(fā)現(xiàn)了5個具有生物活性的聚酮類化合物[2,3]。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，對深海真菌多樣性及其代謝產(chǎn)物的研究越來越多，從中發(fā)現(xiàn)了大量骨架新穎、生物活性顯著的代謝產(chǎn)物[4,5]，特別是在抗菌、抗腫瘤方面，顯示出了很好的活性[6-8]。

Arthriniumsp.是一類廣泛分布的真菌，禾本科和莎草科植物是其最主要的寄主[9]，海洋環(huán)境中也有分布。目前，對該屬真菌代謝產(chǎn)物的研究還較少，但是也已經(jīng)從中發(fā)現(xiàn)了一些結(jié)構(gòu)新穎的代謝產(chǎn)物，并且表現(xiàn)出了良好的生理活性，例如，具有乙酰膽堿酯酶抑制活性和細(xì)胞毒活性的吡啶酮生物堿類[10]、具有細(xì)胞毒活性的聚酮類和松弛素類化合物[11,12]以及具有抗菌活性的灰黃霉素類化合物[13]。為了進一步挖掘海洋來源Arthrinium屬真菌的代謝產(chǎn)物，我們對深海沉積物來源的Arthriniumsp.UJNMF0008的大米發(fā)酵產(chǎn)物進行了提取分離，從中得到5個化合物(圖1)。通過核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)、文獻對照等方法對這些化合物的結(jié)構(gòu)進行了結(jié)構(gòu)鑒定，并對其進行了活性測試，其中化合物1和2為新化合物，但是這些化合物在50 μmoL/L的測定濃度下，沒有表現(xiàn)出明顯的抑制氧自由基、抗菌或者抑制NO釋放的活性。

圖1 化合物1～5的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-5

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

Avance DRX 600核磁共振波譜儀(Brucker)；1260-6460三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent)；6545 Q-TOF高分辨質(zhì)譜(Agilent)；UV-2600紫外分光光度計(Shimadzu)；Rudolph VI 旋光儀(Rudolph)；FT-IR VERTEX70紅外光譜儀(Brucker)；1260高效液相色譜(Agilent)；R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI)；Sephadex LH-20凝膠(GE Healthcare)；檢測用GF254薄層色譜硅膠及分離用柱色譜硅膠(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；分離提取用試劑均為分析純試劑(天津富宇精細(xì)化工有限公司)，高效液相使用色譜純試劑(Oceanpak)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種與發(fā)酵

菌株UJNMF0008分離自南海海洋沉積物(17°55′00″N,115°55′31″E；3 858 m)，菌種保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

用無菌竹簽將真菌Arthriniumsp.JUNMF0008菌種接種于PDA瓊脂培養(yǎng)基上，28 °C培養(yǎng)5天，得到培養(yǎng)有菌種的平板，然后用無菌竹簽挑取適量真菌Arthriniumsp.UJNMF0008菌種接種入含150 mL種子培養(yǎng)基(葡萄糖1.0%，可溶性淀粉1.0%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，蛋白胨0.1%，海鹽3.0%)的500 mL三角瓶中，28 °C搖床(180 rpm)培養(yǎng)3天得到種子液，然后用移液器接種10 mL種子液到裝有大米培養(yǎng)基(80 g大米、0.4 g酵母浸膏、0.4 g葡萄糖、3.6 g海鹽、120 mL水)的1 L三角燒瓶中，共4.8 kg大米，于28 °C靜置培養(yǎng)30天，得到發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離

將所得固體發(fā)酵物用95%乙醇浸泡，浸取液回收乙醇后剩余水相再用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到粗提物(80 g)。所得浸膏經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿/甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脫，結(jié)合TLC檢測，合并得到10個流分(Fr.1-Fr.10)。Fr.6經(jīng)D-101大孔樹脂，以乙醇/水(30%，50%，80%，100%)洗脫，結(jié)合TLC檢測，合并得到4個亞流分(Fr.6-1～Fr.6-4)。Fr.6-3進一步經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿/丙酮(1∶0～0∶1)梯度洗脫，結(jié)合TLC檢測，合并得到9個亞流分(Fr.6-3-1-Fr.6-3-9)；Fr.6-3-2經(jīng)中壓柱層析(MPLC)純化、HPLC制備(甲醇/水，v/v 42：58，3.0 mL/min)得到化合物4(tR=12.4 min,4.6 mg)；Fr.6-3-6經(jīng)中壓柱層析(MPLC)純化、半制備型TLC板制備得到化合物3(4.2 mg)；Fr.6-3-7經(jīng)中壓柱層析(MPLC)純化、HPLC制備(甲醇/水，v/v 42∶58，3.0 mL/min)得到化合物2(tR=11.8 min,3.3 mg)。Fr.7經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿/丙酮(1∶0～0∶1)梯度洗脫，結(jié)合TLC檢測，合并得到3個亞流分(Fr.7-1-Fr.7-3)。Fr.7-2經(jīng)凝膠Sephadex LH-20(氯仿/甲醇 1∶1)純化，進一步通過HPLC制備(甲醇/水，v/v 35∶65，3.0 mL/min)得到化合物5(tR=20.9 min,3.2 mg)。Fr.8經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿/丙酮(1∶0～0∶1)梯度洗脫，結(jié)合TLC檢測，合并得到4個亞流分(Fr.8-1-Fr.8-4)。Fr.8-2經(jīng)中壓柱層析(MPLC)純化，進一步通過HPLC制備(甲醇/水/CH3COOH，v/v/v 34∶66∶10-4，3.0 mL/min)得到化合物1(tR=42.8 min,2.2 mg)。

1.2.3 化合物活性測試

采用DPPH法測定化合物的抗氧自由基活性[14]：在96孔板中加入100 μL，200 μmoL/L的DPPH乙醇溶液和100 μL待測樣品的乙醇溶液(樣品終濃度為50 μmoL/L)，25 °C孵育30 min，于517 nm 處測定反應(yīng)溶液的吸光度AS，以100 μL，200 μmoL/L的DPPH乙醇溶液和100 μL乙醇溶液的混合液作為陰性對照AC，DPPH 自由基清除率(%)= [(AC-AS)/AC]×100%。

采用96孔板法測定化合物的抗菌活性[15]，測試菌株包括革蘭氏陽性菌MycobacteriumsmegmatisATCC 607和StaphylococcusaureusATCC 25923，革蘭氏陰性菌EscherichiacoliATCC 8739和PseudomonasaeruginosaATCC 9027以及真菌CandidaalbicansATCC10231：分別將4株待測細(xì)菌接種到LB培養(yǎng)基中37 °C搖床(180 rpm)培養(yǎng)24小時(真菌接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中28 °C培養(yǎng)48小時)，用LB培養(yǎng)基(真菌用YPD培養(yǎng)基)將培養(yǎng)液的菌種濃度稀釋到104～105cfu/mL，接種于96孔板中，每孔包含200 μL(包含待測樣品50 μmoL/L)培養(yǎng)液，200 μL含菌種的培養(yǎng)液作為對照，200 μL 不含菌種的培養(yǎng)液作為空白，37 °C培養(yǎng)12小時(真菌28 °C培養(yǎng)48小時)，用酶標(biāo)儀檢測各孔在600 nm處的吸光度A值，計算抑菌率(%)，抑菌率(%)= [1-(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

NO釋放抑制活性測定[14]：取對數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中， 5% CO2、37 °C培養(yǎng)24 h，換成無血清培養(yǎng)基，同時加入LPS(終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)和待測樣品 (終濃度為50 μmoL/L)，再培養(yǎng)24 h，然后吸取細(xì)胞上清液，用Griess法測定上清液中NO含量，NO釋放抑制率(%)= [1-(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1～2的1H NMR(600 MHz)和13C NMR(150 MHz)數(shù)據(jù)(DMSO-d6)Table 1 1H NMR (600 MHz) and 13C NMR (150 MHz) data for 1-2 (DMSO-d6)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

Pos.12δC,typeδH (J in Hz )δC,typeδH (J in Hz )845.7,CH3.46,dd (8.0,1.5)41.8,CH3.95,dd (2.3,1.1)8a113.4,C112.1,C9181.1,C181.0,C9a107.9,C108.8,C1062.2,CH24.58,s62.4,CH24.59,brs11172.3,C170.3,C11-OCH351.8,CH33.62,s52.5,CH33.54,s1-OH12.15,s

圖2 化合物1主要的1H-1H COSY、HMBC和NOESY相關(guān)Fig.2 The key 1H-1H COSY,HMBC and NOESY correlations for compound 1

化合物3淡黃色粉末(CH3OH)；1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:6.38 (1H,d,J=1.1 Hz,H-2),7.08 (1H,d,J=1.1 Hz,H-4),8.06 (1H,d,J=8.9 Hz,H-5),8.41 (1H,d,J=8.9 Hz,H-6),4.62 (2H,d,J=2.6 Hz,H-10),3.95 (3H,s,11-OCH3),2.80 (3H,s,S-CH3),5.59 (1H,t,J=5.6 Hz,12-OH),11.86 (1H,s,1-OH)；13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:160.4 (C-1),108.1 (C-2),155.4 (C-3),104.3 (C-4),155.0 (C-4a),121.7 (C-5),157.2 (C-5a),130.4 (C-6),139.0 (C-7),129.8 (C-8),116.6 (C-8a),179.8 (C-9),107.2 (C-9a),62.3 (C-10),166.0 (C-11),53.2 (11-OCH3),43.3 (S-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致，因此鑒定化合物3為sydoxanthone C。

化合物4白色粉末(CH3OH)；1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:4.75 (1H,dq,J=6.6,2.1 Hz,H-3),4.50 (1H,dd,J=6.3,2.1 Hz,H-4),5.71 (1H,d,J=6.3 Hz,4-OH),7.00 (1H,dd,J=8.3,0.9 Hz,H-5),7.58 (1H,dd,J=8.3,8.3 Hz,H-6),6.96 (1H,brd,J=8.3 Hz,H-7),10.96 (1H,s,8-OH),1.40 (3H,d,J=6.6 Hz,H-10)；13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:169.0 (C-1),78.4 (C-3),65.2 (C-4),142.5 (C-4a),116.8 (C-5),136.4 (C-6),118.8 (C-7),160.5 (C-8),107.4 (C-8a),15.8 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道一致，因此鑒定化合物4為(3R,4R)-cis-4-hydroxymellein。

化合物1、2的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

2.2 活性測試結(jié)果

在50 μmoL/L的測定濃度下，化合物1～5對氧自由基、5株測試菌株(Mycobacteriumsmegmatis、Staphylococcusaureus、Escherichiacoli、Pseudomonasaeruginosa、Candidaalbicans)以及NO釋放的抑制率均小于40%，沒有表現(xiàn)出明顯活性(表 2)。

表2 化合物1～5的生物活性測試結(jié)果(50 μmoL/L濃度下的抑制率)Table 2 Biological activity of compounds 1-5 (Inhibition ratio in 50 μmoL/L)

注：MS:MycobacteriumsmegmatisATCC607;SA:StaphylococcusaureusATCC25923;EC:EscherichiacoliATCC 8739;PA:PseudomonasaeruginosaATCC 9027;CA:CandidaalbicansATCC10231。

Note:MS:MycobacteriumsmegmatisATCC607;SA:StaphylococcusaureusATCC25923;EC:EscherichiacoliATCC 8739;PA:PseudomonasaeruginosaATCC 9027;CA:CandidaalbicansATCC10231.

3 討論

海洋真菌能夠產(chǎn)生活性良好、結(jié)構(gòu)豐富的代謝產(chǎn)物，已經(jīng)成為藥物先導(dǎo)化合物的研究熱點，在抗腫瘤、抗感染、抗病毒、抗瘧疾藥物開發(fā)方面顯示出了巨大的潛力。但是，雖然目前從不同海洋樣品來源的真菌中發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物已經(jīng)幾千個，進入臨床的化合物卻寥寥無幾，使得大量潛在的先導(dǎo)化合物無法成為真正的藥物[7]。因此，如何充分挖掘海洋真菌代謝產(chǎn)物的生物活性、優(yōu)化先導(dǎo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)評估先導(dǎo)化合物的成藥性成為海洋藥物研究的難點。本文對海洋沉積物來源的真菌Arthriniumsp.UJNMF0008的代謝產(chǎn)物進行了研究，從中發(fā)現(xiàn)了5個聚酮類化合物，并對其進行了活性測試，在50 μmoL/L的測定濃度下，化合物1～5對氧自由基、5株測試菌株以及NO釋放的抑制率均小于40%。我們將進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，挖掘該菌株的代謝產(chǎn)物多樣性及其生物活性，為海洋藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供基礎(chǔ)。