陳麗華，王鈞篪，喬月，王慧娟，沈連鋼，廖永紅，孫迪安，斯建勇

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

吡咯里西啶生物堿(pyrrolizidine alkaloids，PA)是一類天然的植物毒素，主要分布于菊科、豆科和紫草科等植物中[1-3]。除嚴(yán)重的肝毒性[4]之外，PA還具有神經(jīng)毒性[5]、細(xì)胞毒性[6]以及基因毒性[7]，目前PA受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

番瀉葉為豆科植物狹葉番瀉CassiaangustifoliaVahl或尖葉番瀉CassiaacutifoliaDelile的干燥小葉[8]，具有瀉下導(dǎo)滯、通便利水等藥理作用[9-10]。其主要含有蒽醌、黃酮、揮發(fā)油等化學(xué)成分[11]，氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)法測(cè)定番瀉葉中的成分，研究結(jié)果顯示，其存在少量的含氮類成分[12]。

據(jù)報(bào)道，研究人員在部分中藥材及茶葉中檢測(cè)出較高含量PA[13-14]，這一結(jié)果意味著PA存在于許多藥用植物中，但對(duì)于其他的中藥材中是否存在PA及其含量的研究仍然比較缺乏。因此，為了檢測(cè)番瀉葉中PA的含量，為其安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)，本研究采用超聲法及陽(yáng)離子交換固相萃取技術(shù)[15]對(duì)番瀉葉進(jìn)行提取富集，并通過(guò)UPLC-MS/MS法對(duì)其PA含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290型超高效液相色譜-G6470三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；TGA Q50熱重分析儀(美國(guó)TA公司)；MULTI-SPE M08固相萃取裝置(天津博納艾杰爾科技有限公司)；NV-15G氮?dú)獯蹈蓛x(天津博納艾杰爾科技有限公司)；臺(tái)式低速離心機(jī)(上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司)；JR-500D液晶超聲波清洗器[精銳澤祥(北京)儀器有限公司]。

1.2 試藥

14個(gè)PA對(duì)照品：野百合堿(Monocrotaline，Mc)及其N-氧化物(MonocrotalineN-oxide，McNO)、歐天芥菜堿(Europine，Eu)及其N-氧化物(EuropineN-oxide，EuNO)、天芥菜堿(Heliotrine，He)及其N-氧化物(HeliotrineN-oxide，HeNO)、千里光寧堿(Senecionine，Sn)及其N-氧化物(SenecionineN-oxide，SnNO)、Intermedine(Im)及其N-oxide(ImNO)、Lycopsamine(Ly)及其N-oxide(LyNO)、克氏千里光堿(Senkirkine，Sk)、毛束草堿(Trichodesmine，Td)均購(gòu)自德國(guó)PhytoLab公司(純度≥95%)。其結(jié)構(gòu)式見圖1。

色譜純甲醇、乙腈購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；色譜純甲酸購(gòu)于DIKMA科技(北京)公司；實(shí)驗(yàn)室所用水為屈臣氏蒸餾水；濃氨水、濃硫酸(98%)購(gòu)自北京化工廠；混合型陽(yáng)離子固相萃取小柱(Cleanert PCX)；Hamilton微量進(jìn)樣器等。

不同來(lái)源的番瀉葉樣本共12批，購(gòu)自印度尼西亞、緬甸及中國(guó)的海南、廣東、廣西等地，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定為狹葉番瀉CassiaangustifoliaVahl或尖葉番瀉CassiaacutifoliaDelile的干燥小葉，標(biāo)本保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。

圖1 14個(gè)PA化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取每個(gè)PA對(duì)照品約1 mg，用乙腈溶解并定容在10 mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，于-20 ℃密封保存。用Hamilton 微量進(jìn)樣器分別吸取上述14個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液100 μL到10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，搖勻，得1 mg·L-1PA混合溶液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱，待用。

2.2 供試品溶液的處理

2.2.1 樣品的提取 精密稱取過(guò)60目篩的樣品粉末2.000 0 g(±0.000 5 g)于50 mL的錐形瓶中，加95%甲醇水溶液40 mL，常溫下超聲提取30 min，以6000 r·min-1離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL的燒杯中，50 ℃水浴揮干。

2.2.2 陽(yáng)離子交換固相萃取小柱PCX-SPE的凈化 經(jīng)10 mL 0.05 mol·L-1硫酸水溶解2.2.1項(xiàng)中揮干的浸膏后，過(guò)PCX-SPE萃取小柱。先用5 mL甲醇平衡PCX-SPE萃取柱，5 mL 0.05 mol·L-1硫酸水活化，然后取溶解后的提取液進(jìn)行上樣，分別用0.05 mol·L-1硫酸水5 mL、甲醇5 mL各淋洗兩次，固相萃取裝置吹干，25%氨水-甲醇5 mL洗脫兩次。洗脫液在50 ℃氮吹儀下吹干。

2.2.3 樣品的復(fù)溶 洗脫液吹干后用甲醇-水(50∶50，V∶V)復(fù)溶，定容至2 mL容量瓶，過(guò)0.22 μm濾膜。取1.0～1.5 mL至液相小瓶以供UPLC-MS/MS分析。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×3.0 mm，1.8 μm)，流動(dòng)相A：0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B：0.1%甲酸-甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，5%～20%B；1～4 min，20%～30%B；4～5 min，30%～37%B；5～8 min，37%～50%B；8～8.5 min，50%～5%B；8.5～10 min，5%B；后運(yùn)行時(shí)間：1 min。柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.4 mL·min-1。14個(gè)PA混標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流圖(MRM)見圖2。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子化模式：ESI/安捷倫噴射流離子聚焦離子源，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；毛細(xì)管電壓：3500 V；噴嘴電壓：500 V；干燥氣流速：7 L·min-1；干燥氣溫度：300 ℃；霧化氣壓力：275.8 kPa；鞘流氣溫度：325 ℃；鞘流氣流速：11 L·min-1。質(zhì)譜優(yōu)化條件參數(shù)見表1。

注：1.Mc；2.McNO；3.Eu；4.EuNO；5.He；6.HeNO；7.Sn；8.SnNO；9.Im；10.ImNO；11.Ly；12.LyNO；13.Sk；14.Td。圖2 14個(gè)PA混標(biāo)溶液(質(zhì)量濃度為20 μg·L-1)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系和檢出限、定量限 取1 mg·L-1的PA混合對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋成1、2、5、10、20、50、100、200 μg·L-18個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按照2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品溶液的濃度(X)為橫坐標(biāo)，其色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，14個(gè)PA的相關(guān)系數(shù)r均大于0.990 5，即PA在1～200 μg·L-1線性關(guān)系良好。以信噪比(S/N)大于3為檢出限，S/N大于10為定量限。14個(gè)PA化合物的線性回歸方程及檢出限、定量限見表2。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄14個(gè)PA化合物的峰面積，計(jì)算其RSD值為1.64%～3.37%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.2方法進(jìn)行制備，在2.3項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，日內(nèi)平行測(cè)定5次；連續(xù)實(shí)驗(yàn)3 d，每天平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度RSD值為1.23%～5.63%，日間精密度RSD值為2.10%～5.96%，表明穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批次番瀉葉樣品6份，按2.2方法制備供試品溶液，在2.3條件下測(cè)定，計(jì)算各PA化合物的RSD值為1.56%～5.49%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率 精密稱取同一批次的番瀉葉供試品9份，加入高、中、低3個(gè)不同濃度的混標(biāo)溶液，每個(gè)濃度按照2.2方法分別制備3份供試品溶液，在2.3條件下測(cè)定回收率，結(jié)果見表3。

表1 PA化合物的UPLC-MS/MS質(zhì)譜條件優(yōu)化

表2 14個(gè)PA化合物的線性回歸方程及檢出限、定量限 μg·L-1

表3 14個(gè)PA化合物加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3) %

3 番瀉葉樣品中PA含量測(cè)定及日攝入量分析

3.1 樣品中PA含量檢測(cè)結(jié)果

取12批番瀉葉樣品，分別按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)條件分析測(cè)定，每個(gè)批次樣品重復(fù)3次，取平均值，測(cè)定結(jié)果分別見表4和圖3。

表4 12批番瀉葉中總PA化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3)

圖3 12批番瀉葉中PA化合物的分布及其含量

3.2 番瀉葉樣品中PA日攝入量分析

2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定：番瀉葉的用量為2～6 g[8]，由此計(jì)算12批番瀉葉中PA的最低日攝入量為0.01～0.38 μg，最高日攝入量為0.04～1.13 μg。根據(jù)歐盟指南中PA基準(zhǔn)數(shù)值的建議[16]，體質(zhì)量為60 kg的成人單日攝入量不超過(guò)0.42 μg?；谠揚(yáng)A基準(zhǔn)值，按最低用量計(jì)算，12批番瀉葉藥材中PA均不超過(guò)此基準(zhǔn)值；按最高用量計(jì)算，其中5批樣品中PA日攝入量超過(guò)0.42 μg，且有一個(gè)購(gòu)自云南的藥材超標(biāo)約3倍(見圖4)。

圖4 12批番瀉葉樣品中PA化合物的日攝入量

4 討論

本研究所建立的UPLC-MS/MS技術(shù)具有高效、快速、靈敏的特點(diǎn)，可用于同時(shí)檢測(cè)番瀉葉藥材中PA成分的含量。由于PA能夠在動(dòng)物或人體內(nèi)殘留，即使含量很低，也足應(yīng)引起警惕。

本實(shí)驗(yàn)首次檢測(cè)出番瀉葉中含有PA成分，主要為野百合堿及其N-氧化物、毛束草堿、歐天芥菜堿N-氧化物以及天芥菜堿N-氧化物這5種PA化合物。其中，除購(gòu)自廣西的樣品不含McNO外，各批次藥材中McNO的含量所占比例最高(緬甸藥材除外)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)117.70 μg·kg-1；另外，除了購(gòu)自緬甸和廣西的樣品，其余批次的藥材均檢測(cè)到含有Mc和Td；超過(guò)一半的番瀉葉藥材中檢測(cè)出EuNO和HeNO這2種PA成分。由此推測(cè)以上5種PA成分可能是番瀉葉的內(nèi)源性物質(zhì)。在單個(gè)樣品中分別檢測(cè)出少量其余的PA化合物，有可能是外源性污染。

12批番瀉葉藥材中，1個(gè)購(gòu)自印度尼西亞、2個(gè)分別購(gòu)自云南和海南的藥材PA含量比較高，根據(jù)番瀉葉的最高用量計(jì)算，這5個(gè)批次的藥材PA最高日攝入量超過(guò)歐盟PA基準(zhǔn)值，它們的PA總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.56～187.97 μg·kg-1；購(gòu)自廣西和四川等地的PA含量則較低。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的番瀉葉藥材中PA含量具有較為顯著的差異，因此可能要購(gòu)買更多樣品對(duì)其做進(jìn)一步的研究分析。鑒于PA廣泛存在于多種植物并且具有嚴(yán)重的毒性，建立番瀉葉中PA檢測(cè)方法及加強(qiáng)對(duì)番瀉葉中PA含量監(jiān)管非常有必要。