馮劍，劉培衛(wèi)，楊云，歐陽冬青，劉洋洋，2*，魏建和，2*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所/海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室，海南 ?？?570311；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，瀕危藥材繁育國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

沉香為瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilaria和擬沉香屬Gyrinops植物的含有樹脂的木材，是名貴藥材和香料[1-2]。晉代《南方草木狀》[3]及唐代《新修本草》[4]均記載：“蜜香、沉香、雞骨香、黃熟香、棧香、青桂香、馬蹄香、雞舌香，按此八物，同出一樹也……其根、干、枝、節(jié)各有別色也。細(xì)枝緊實(shí)未爛者，為青桂香”。青桂香即為樹枝(青色樹皮)形成的沉香。不同部位結(jié)香種類可分為“四名十二狀”，青桂香屬于生結(jié)沉香，稱其為皮油”。

沉香一般是在莖、根、枝的木質(zhì)部中形成，樹皮很薄，占比不大，易干枯或腐爛，很少形成沉香，因此，皮油現(xiàn)存量很少，一般認(rèn)為一旦形成其品質(zhì)較好，比較獨(dú)特。目前僅有對海南產(chǎn)皮油沉香揮發(fā)性成分進(jìn)行了GC-MS初步分析，發(fā)現(xiàn)含倍半萜成分較多[5]，但國內(nèi)外對皮油沉香結(jié)構(gòu)、物種基原、品質(zhì)評價(jià)等方面的科學(xué)研究未見報(bào)道。因此，本文從皮油沉香形態(tài)特征、顯微結(jié)構(gòu)、物種基原及化學(xué)成分進(jìn)行分析，旨在科學(xué)的認(rèn)識和利用皮油沉香，為其鑒定和品質(zhì)評價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)的材料是從市場上收集到典型的皮油沉香樣品(PC01、PC02、PC03)3份，以通體香沉香TC01(通體結(jié)香技術(shù)生產(chǎn))1份和板頭香沉香BC01(全斷桿法生產(chǎn))1份作為對照(圖1)。經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所劉洋洋副研究員鑒定，均為含有樹脂的沉香木材，憑證標(biāo)本保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所沉香鑒定中心標(biāo)本館。

圖1 實(shí)驗(yàn)用沉香樣品

1.2 儀器

PCR儀(Bio-Rad，美國)；核酸定量分析儀(Nanodrop 2000，美國Thermo)；臺式高速冷凍離心機(jī)(MIKRO 220R，德國 Hettich)；凝膠成像儀(SC910，杭州得聚儀器設(shè)備有限公司)；電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975C，美國 Agilent)；高效液相色譜儀(1525，美國Waters)；生物顯微鏡(Eclipse，日本NiKon)；電子天平(LE104E，瑞士Mettler Toledo)；超聲波清洗儀(PS-40，深圳市潔威超聲波)；HP-5MS% Phenyl Silox(30 m×250 μm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管。

1.3 試劑

HP Plant DNA Kit(50)試劑盒(OMEGA)；引物(華大基因)；2×EasyTaqPCR SuperMix(-dye)(Trans Gen)；瓊脂糖(Biowest agarose)；Marker D2000(中科瑞泰)；沉香對照藥材(121222-201203)和沉香四醇對照品(111980-201601，純度96.8%)購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為HPLC級，異丙醇、β-巰基乙醇為優(yōu)質(zhì)級，乙醚、無水乙醇和95%乙醇等均為分析級。

2 方法

2.1 感官評價(jià)方法

對收集的皮油沉香樣品，從外觀形態(tài)(形狀、斷面、皮部特征)、色澤、油性、氣味及樹脂(醇溶性浸出物)含量等方面進(jìn)行評價(jià)。

2.2 顯微結(jié)構(gòu)觀察

取沉香樣品切成方塊狀，置于包埋盒中，水浴煮至柔軟，經(jīng)軟化、切片和透明，采用徒手滑走切片，再經(jīng)水合氯醛溶劑透化后，在生物顯微鏡下觀察樣品切面結(jié)構(gòu)。

2.3 物種鑒定

2.3.1 DNA提取 取沉香干燥樣品，刮去表面的雜質(zhì)，用75%的酒精棉球擦拭樣品表面，晾干后用無菌刀片切碎樣品，稱取0.10 g，放置在2 mL的離心管中，充入液氮，高通量組織研磨儀中研磨2 min。用改良的OMEGA HP plant DNA提取試劑盒提取DNA，加入1000 μL預(yù)熱的CPL和10 μL的β-巰基乙醇，溫浴，其余步驟按照試劑盒說明書操作。測定總DNA的濃度，并計(jì)算OD260與OD280的比例，并將提取的DNA保存于-20 ℃冰箱，備用。

2.3.2 PCR擴(kuò)增和電泳檢測 PCR體系總體積為25 μL，其中包含：2×EasyTaqPCR SuperMix(-dye)(+dye)12.5 μL、DNA模板2 μL、引物各1 μL，dd H2O 8.5 μL。引物采用通用引物ITS2(ITS2-F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS2-R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT)。PCR儀擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀拍照記錄分析。

2.3.3 PCR產(chǎn)物測序及序列數(shù)據(jù)分析 PCR產(chǎn)物直接使用測序儀進(jìn)行雙向測序，序列拼接軟件CodonCode Aligner V3.7.1 對測序峰圖進(jìn)行拼接，去除引物區(qū)及低質(zhì)量序列；基于隱馬爾科夫模型(HMMs)，去除5.8 s和26 s區(qū)域獲得ITS2序列。從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜集并下載沉香屬ITS2序列，整合處理后結(jié)合樣品序列，進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的比較，并建立NJ和MP系統(tǒng)發(fā)育樹，分析沉香與其同屬沉香的親緣關(guān)系。

2.4 化學(xué)成分分析

2.4.1 揮發(fā)性成分分析

2.4.1.1 樣品制備 取0.20 g沉香樣品粉末加入乙醚溶劑超聲提取3次(5 mL/次)，每次超聲15 min，靜置5 min后0.22 μm過濾得到乙醚提取液，合并濾液，自然揮干后得到5份沉香樣品的油狀提取物(提取得率分別16.5%、4.0%、11.8%、10.2%、8.2%)，氣味芳香，香味獨(dú)特、濃郁。加乙醚溶解后GC-MS進(jìn)樣分析。

2.4.1.2 色譜條件 1)色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm，0.25 μm)；2)升溫程序：柱溫50 ℃，保持1 min，以15 ℃·min-1升溫至140 ℃并保持1 min，然后以1 ℃·min-1升至160 ℃并保持2 min，最后以15 ℃·min-1升至250 ℃，進(jìn)樣口溫度240 ℃；3)載氣為高純He，載氣(He)流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量1 μL；4)分流比20∶1，溶劑延遲時(shí)間4 min；5)電子轟擊(EI)離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度260 ℃，質(zhì)量掃描范圍40～300m/z。

2.4.1.3 化合物鑒定 樣品經(jīng)GC-MS分析后，通過MSD化學(xué)工作站，結(jié)合NIST11質(zhì)譜圖庫對各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索與定性，并按峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對含量。

2.4.2 沉香特征圖譜及沉香四醇含量測定

2.4.2.1 樣品制備 取沉香四醇對照品，精密稱定，用95%乙醇溶解制成60 μg·mL-1溶液。精密稱定沉香樣品粉末0.20 g，置具塞錐形瓶中，精密加入10 mL 95%乙醇，稱定質(zhì)量，浸泡0.5 h，超聲處理1 h，放冷后稱定質(zhì)量，用95%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清濾液，即得。

2.4.2.2 色譜條件 參照《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)方法，選用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫條件。流速0.7 mL，柱溫30 ℃，檢測波長為252 nm[6]。

(2)粉煤灰吹填施工。相較于其他的填土材料，粉煤灰有著超強(qiáng)的透水性。使用這種材料能夠降低填土費(fèi)用，并且利用其超強(qiáng)的透水性能夠加速吹填土的凝固。具體應(yīng)用時(shí)要將粉煤灰和淤泥根據(jù)一定比例混合吹填，保證均勻吹填，從而改善土層固結(jié)特性。

3 結(jié)果與分析

3.1 沉香樣品感官特征

皮油沉香市場現(xiàn)存量低，對市場上購置的3批典型皮油沉香(PC01、PC02和PC03)進(jìn)行感官特征評價(jià)，并以通體香沉香(TC01)和板頭香沉香(BC01)作為對比(表1)。皮油沉香外觀形狀多呈不規(guī)則的片塊，纖維多，外皮可見角質(zhì)化的皮組織，內(nèi)皮層色澤較深可見棕色樹脂，質(zhì)地柔軟或較硬，具有清涼或甜蜜香味，醇溶性浸出物含量符合《中國藥典》規(guī)定。

表1 沉香樣品感官特征

注：—表示產(chǎn)地不明確。

3.2 沉香顯微結(jié)構(gòu)

3批皮油沉香樣品顯微結(jié)構(gòu)顯示(圖2)，皮油沉香PC01與通體香沉香TC01、板頭香沉香BC01樣品橫向切面(A1、A4、A5)具有典型的木間韌皮部、射線和導(dǎo)管等沉香顯微結(jié)構(gòu)，徑向切面(B1、B4、B5)及切向切面(C1、C4、C5)也可以觀察到明顯的射線和導(dǎo)管。但皮油沉香PC02、PC03樣品的橫向切面、徑向切面顯微結(jié)構(gòu)明顯不同于典型的沉香特征結(jié)構(gòu)，韌皮纖維發(fā)達(dá)，射線多呈束，壁稍厚，不規(guī)則排列，木間韌皮部與射線交聯(lián)，呈棕色至棕黃色。韌皮薄壁細(xì)胞多成不規(guī)則，細(xì)胞徑向延長，部分被纖維隔斷成不規(guī)則。射線寬1至多列細(xì)胞，充滿樹脂。

注：A、B及C分別為橫向切面、徑向面和切向切面；1～3為3批皮油沉香樣品；4為通體香沉香；5為板頭香沉香；P為韌皮部；IP為木間韌皮部；XR為射線；V為導(dǎo)管。圖2 沉香樣品顯微結(jié)構(gòu)

3.3 沉香樣品物種鑒定

對5批沉香樣品進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖見圖3。經(jīng)去除5.8 s和26 s區(qū)域獲得ITS2片段序列的實(shí)際長度為230 bp，3批皮油沉香樣品的GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為57.39%、57.83%和57.83%，與GenBank數(shù)據(jù)庫的沉香屬AquilariaLam.物種的ITS2序列進(jìn)行比對，進(jìn)行ITS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及比對(Schultz et al.，2006)，3批皮油沉香樣品的二級結(jié)構(gòu)見圖4所示，ITS2 二級結(jié)構(gòu)與白木香Aquilariasinensi(Lour.)Gilg(GI238696002)一致，E-value為4.875 285 235 088 5e-119，ITS2二級結(jié)構(gòu)均含有螺旋(Helix)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ。其中，螺旋Ⅱ結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，包含有CCGU和UGG的圖案結(jié)構(gòu)。ITS2序列NJ和MP聚類樹拓?fù)錁?gòu)型基本一致(圖5、圖6)，Bootstrap重復(fù)1000次，枝上數(shù)值顯示自展率為≥50%。在構(gòu)建的NJ和MP聚類樹中3批皮油沉香、通體香沉香和板頭香沉香樣品均與A.sinensis聚成一支，自展支持率分別為84%和86%。由NJ樹和MP樹可以明確3批皮油沉香樣品的基原為白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg。此外，對物種進(jìn)行種內(nèi)種間Kimura 2-parameter(K2P)遺傳距離分析表明，皮油沉香樣品與A.sinensis的遺傳距離最近。

圖3 沉香樣品PCR擴(kuò)增電泳圖

圖4 皮油沉香ITS2二級結(jié)構(gòu)

圖5 基于ITS2序列構(gòu)建的沉香樣品NJ樹

圖6 基于ITS2序列構(gòu)建的沉香樣品MP樹

3.4 沉香GC-MS成分分析

不同沉香樣品乙醚提取物GC-MS總離子流圖有明顯差異，見圖7。3批皮油沉香樣品的乙醚萃取物檢測到倍半萜類成分分別為36、27和29；通體香沉香和板頭香沉香的乙醚提取物中倍半萜類成分為22和30種。對35種倍半萜類化合物和5種特殊的芳香族化合物進(jìn)行比對分析(表2)。其中皮油沉香與通體香沉香、板頭香沉香樣品中共有的成分為芐基丙酮(4-phenyl-2-butanone)、α-檀香醇(α-santalol)、沉香螺旋醇(agarospirol)。其中，沉香螺旋醇為沉香的特征性成分，已有文獻(xiàn)報(bào)道[11]。此外，3批皮油沉香樣品間的化學(xué)成分差異也較大，皮油沉香與通體香沉香和板頭香沉香的氣味有所差異，也可能是含有這些特殊的成分所致。

注：A、B、C為3批皮油沉香；D為通體香沉香；E為板頭香沉香。 圖7 沉香樣品乙醚提取物GC-MS總離子流圖

表2 沉香樣品揮發(fā)性成分及其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：—表示未檢出。

3.5 沉香特征圖譜及沉香四醇含量

3批皮油沉香的特征圖譜均與通體香沉香和板頭香沉香呈現(xiàn)的6個(gè)特征峰與《中國藥典》規(guī)定的一致，且峰1為沉香四醇(圖8)。PC01、PC02、PC03、TC01和BC01的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為75.937(0.38%)、44.398(0.22%)、374.176(1.87%)、125.561(0.62%)、63.567 μg·mL-1(0.32%)。3批皮油沉香樣品沉香四醇含量均符合《中國藥典》規(guī)定的含量限值不得低于0.1%，其中皮油沉香PC03的含量最高。

4 結(jié)論與討論

4.1 皮油沉香基本特征及定義

皮油沉香外觀較為特殊，目前皮油沉香市場現(xiàn)存量極低，在野外也不易獲取，有學(xué)者認(rèn)為皮油沉香是指白木香樹皮受傷，汁液泛出，在樹皮處所結(jié)的沉香[5]。針對皮油沉香并未有明確的定義，本研究從市場上收集了3批較為典型的皮油沉香樣品，經(jīng)DNA條形碼鑒定基原為白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg.，同時(shí)對其進(jìn)行了外觀形態(tài)形征及微觀結(jié)構(gòu)初步描述。皮油沉香外觀形狀多呈不規(guī)則的片塊，外皮可見角質(zhì)化的皮組織斑塊，內(nèi)皮層色澤較深可見棕色樹脂斑點(diǎn)或條帶，纖維多，多呈棕黃色(圖9)，質(zhì)地柔軟或較硬，一般具有清涼或甜蜜花香味。市場上也有常見的火燒樹的方法形成的薄片狀的沉香，結(jié)香面在內(nèi)側(cè)，易與皮油沉香相混淆。3批皮油沉香樣品中，只有1批符合典型的沉香特征結(jié)構(gòu)，2批皮油沉香樣品的橫向切面、徑向切面顯微結(jié)構(gòu)明顯不同于典型的沉香特征結(jié)構(gòu)，但皮油沉香顯微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為韌皮纖維發(fā)達(dá)，射線多呈束，壁稍厚，不規(guī)則排列，木間韌皮部與射線交聯(lián)，呈棕色至金黃色。韌皮薄壁細(xì)胞多成不規(guī)則，細(xì)胞徑向延長，部分被纖維隔斷成不規(guī)則。射線寬1至多列細(xì)胞，充滿樹脂。

注：A為中檢院沉香對照藥材；B、C、D為3批皮油沉香；E為通體香沉香；F為板頭香沉香。圖8 沉香樣品HPLC特征圖譜

因此，結(jié)合皮油沉香的宏觀形態(tài)和微觀顯微結(jié)構(gòu)，課題組提出了皮油沉香的定義，可供業(yè)內(nèi)參考：皮油沉香(agarwood‘bark’)為瑞香科沉香屬植物樹皮至形成層之間的組織(有些也包含了部分木質(zhì)部組織)，受到外界因素的傷害形成的含有樹脂的木材。外側(cè)具有明顯的角質(zhì)化皮組織斑塊，內(nèi)側(cè)色澤較深可見棕色樹脂斑點(diǎn)或條帶，斷面纖維眾多。

圖9 皮油沉香樣品宏觀結(jié)構(gòu)

4.2 皮油沉香化學(xué)成分與品質(zhì)特征

此外，皮油沉香與通體香沉香和板頭香沉香的氣味有所差異，可能是含有特殊的芳香族成分引起，皮油沉香PC01樣品中含有似松木樹脂及溫和木香氣味的異松油烯，也含有可作為定香劑的成分氫化肉桂酸，皮油沉香PC02樣品中含有具有玫瑰花香的芐丁醚，皮油沉香PC03樣品中含有具芳香氣味的對二甲苯，這些成分可使皮油沉香，具有香氣清涼，散發(fā)花香、蜜香氣味。