于凡，宋顏君，孫曉媛，許利嘉*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

兩色金雞菊CoreopsistinctoriaNutt.系菊科金雞菊屬的頭狀花序。原產(chǎn)于北美，現(xiàn)在已分布世界各地，過去的幾十年在新疆的高原地區(qū)(3000 m以上)廣泛栽培[1-2]，以和田地區(qū)質(zhì)量為佳，又稱昆侖雪菊[3]。《新華本草綱要》記載，蛇目菊具有清熱解毒、活血化瘀之功效，主治燥熱煩渴等病癥。在葡萄牙，兩色金雞菊被稱為“Estrelas-do-Egipto”，有用于控制糖尿病的傳統(tǒng)應(yīng)用[4]。維吾爾人用兩色金雞菊頭狀花序作為草藥茶來治療高血壓和腹瀉。

兩色金雞菊主要含有黃酮類、苯丙素類、萜類、生物堿、糖類、皂苷類等化合物，研究表明，黃酮類成分是兩色金雞菊主要的藥理活性成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)18.3%[5]。兩色金雞菊的藥理研究也多是針對其黃酮部位的研究，現(xiàn)代藥理研究表明，兩色金雞菊富含黃酮類，可以調(diào)節(jié)血糖、血脂和血壓[6-8]。目前雖有對兩色金雞菊粗提物進(jìn)行含量測定的研究[9-11]，但多是對5～8個(gè)化合物建立含量測定方法，缺乏系統(tǒng)研究，且對羥基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、圣草酚及紫鉚花素尚缺乏含量測定報(bào)道。通過超高效液相方法建立了兩色金雞菊10種成分含量測定方法，為其質(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

賽默飛ScientificTMDionexTMUltiMateTM3000 DAD液相色譜；Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

超純水(Millipore公司，美國)；甲醇、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)；乙醇、甲醇(分析純，北京化學(xué)試劑公司)；甲酸(色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；大孔樹脂HP-20(安徽三星樹脂科技有限公司)；馬里苷(永健醫(yī)藥，批號：102027)；奧卡寧(永健醫(yī)藥，批號：101932)；2R/S-異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷(永健醫(yī)藥，批號：101952)；圣草酚(永健醫(yī)藥，批號：102151)；槲皮萬壽菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷(永健醫(yī)藥，批號：102099)；對羥基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(永健醫(yī)藥，批號：102019)；槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(永健醫(yī)藥，批號：101966)；異奧卡寧(永健醫(yī)藥，批號：102056)；金雞菊苷(永健醫(yī)藥，批號：102039)；紫鉚花素(永健醫(yī)藥，批號：102166)。兩色金雞菊購自新疆地區(qū)，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所陳四保研究員鑒定為兩色金雞菊。

2 方法與結(jié)果

2.1 兩色金雞菊總黃酮的制備

干燥兩色金雞菊頭狀花序100 kg，經(jīng)80%甲醇浸泡，回流提取3次。減壓濃縮成水溶液80 L。經(jīng)大孔樹脂HP-20柱層析，采用乙醇水梯度洗脫，其中70%乙醇洗脫的部分，減壓濃縮成浸膏405 g。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取10種對照品，置1 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容至刻度，混勻，得到各對照品的儲(chǔ)備液。將各對照品的儲(chǔ)備液各取適量后，置于5 mL容量瓶中，混勻，并用80%甲醇定容至刻度，混勻后得混合對照品的儲(chǔ)備液?；旌蠈φ掌返膬?chǔ)備液中，各對照品質(zhì)量濃度分別為：2R/S-異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷(1)4.11 mg·mL-1、對羥基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)0.184 mg·mL-1、槲皮萬壽菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷(3)1.55 mg·mL-1、異奧卡寧(4)1.019 mg·mL-1、槲皮素-7-O-葡萄糖苷(5)0.405 mg·mL-1、馬里苷(6)2.576 mg·mL-1、金雞菊查爾酮(7)0.127 mg·mL-1、奧卡寧(8)1.083 mg·mL-1、圣草酚(9)0.151 mg·mL-1、紫鉚花素(10)0.188 mg·mL-1。對照品溶液均儲(chǔ)存在4 ℃。

2.3 供試品溶液的制備

取兩色金雞菊浸膏，精密稱取粉末約50 mg于5 mL的容量瓶中，精密加入相應(yīng)體積的80%甲醇至近刻度，超聲提取40 min，放置室溫，用80%甲醇定容至刻度，0.22 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4 UPLC分析條件

采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水(B)和乙腈(C)，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～1 min，95%B；1～2 min，95%～90%B；2～6 min，90%B；6～9 min，90%～88%B；9～15 min，88%～85%B；15～18 min，85%B；18～25 min，85%～80%B；25～31 min，80%～78%B；31～36 min，78%～60%B；36～42 min，60%B。流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；紫外檢測波長為285、378 nm；進(jìn)樣體積為3 μL。其中化合物3、5、6、7、8、10的紫外檢測波長選擇響應(yīng)值較高的378 nm。采用賽默飛Scientific Dionex Chromeleon軟件采集數(shù)據(jù)并分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 取混合對照品儲(chǔ)備溶液，加80%甲醇梯度稀釋成不同濃度的混合對照品溶液，取3 μL進(jìn)樣分析。以峰面積值為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，各對照品在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

注：1.2R/S-異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷；2.對羥基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；3.槲皮萬壽菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷；4.異奧卡寧；5.槲皮素-7-O-葡萄糖苷；6.馬里苷；7.金雞菊查爾酮；8.奧卡寧；9.圣草酚；10.紫鉚花素。圖1 10種對照品的UPLC圖

2.5.2 最小檢測限和最小定量限 將各對照品儲(chǔ)備液多次稀釋，進(jìn)行分析，得到各對照品的最小檢測限(LOD)和最小定量限(LOQ)。最小檢測限和最小定量限定義為信噪比分別等于3(S/N=3)和10(S/N=10)時(shí)對應(yīng)的對照品濃度，結(jié)果見表1。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取同一份樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.4項(xiàng)下色譜條件測定，考察各共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積。結(jié)果相對保留時(shí)間RSD<1.12%，相對峰面積RSD<2.97%，表明精密度良好。結(jié)果見表1。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份樣品溶液，分別在配置后的0、2、4、8、12、24 h測定，以峰面積的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為指標(biāo)評價(jià)樣品的穩(wěn)定性，10種對照品的RSD均小于3.77%。，相對保留時(shí)間RSD<0.32%，結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品6份，按2.3項(xiàng)下供試品溶液方法制備，按2.4項(xiàng)下色譜條件測定各對照品的含量，RSD值分別為：1.75%(1)、2.71%(2)、2.51%(3)、2.18%(4)、3.33%(5)、1.66%(6)、1.77%(7)、1.80%(8)、1.76%(9)、1.76%(10)。表明此方法的重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品9份，每份約50 mg，精密稱定，分別按高、中、低含量加入10種對照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，回收率的測定結(jié)果見表2。回收率范圍在97.38%～101.26%，表明該方法有良好的準(zhǔn)確度。

表1 兩色金雞菊總黃酮10種成分的線性回歸分析與精密度試驗(yàn)

表2 兩色金雞菊總黃酮10種成分的加樣回收率試驗(yàn)(n=9)

2.6 兩色金雞菊中10種成分含量測定

分別精密稱取3份樣品，約50 mg，按照2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，按照2.4項(xiàng)下所建立的分析方法進(jìn)行測定，計(jì)算各樣品中10種成分的含量，含量測定結(jié)果見表3。

注：1.2R/S-異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷；2.對羥基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；3.槲皮萬壽菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷；4.異奧卡寧；5.槲皮素-7-O-葡萄糖苷；6.馬里苷；7.金雞菊查爾酮；8.奧卡寧；9.圣草酚；10.紫鉚花素。圖2 兩色金雞菊總黃酮部位的UPLC圖

化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)12R/S-異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷278.002對羥基桂皮酸甲酯-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷8.043槲皮萬壽菊素-7-O-β-D-葡萄糖苷51.304異奧卡寧64.805槲皮素-7-O-葡萄糖苷11.106馬里苷230.007金雞菊查爾酮7.548奧卡寧48.409圣草酚6.0710紫鉚花素2.78

3 討論

兩色金雞菊作為茶飲在我國民間被長期應(yīng)用，多用于控制高血壓、高血脂、高血糖。維吾爾人用兩色金雞菊頭狀花序作為草藥茶來治療高血壓和腹瀉?，F(xiàn)代藥理研究表明，兩色金雞菊茶飲具有改善胰島素抵抗、增加胰島素敏感性作用[12]；兩色金雞菊乙酸乙酯部位能夠改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病模型及其并發(fā)癥[13-14]，如腎纖維化等?；趦缮痣u菊良好的藥效，需進(jìn)一步研究兩色金雞菊的藥效物質(zhì)，目前雖有對兩色金雞菊粗提物進(jìn)行含量測定的相關(guān)研究[9-11]，但多是建立5～8個(gè)化合物的含量測定方法，缺乏系統(tǒng)全面的質(zhì)量控制。為進(jìn)一步富集兩色金雞菊總黃酮，采用大孔樹脂對兩色金雞菊粗提物進(jìn)行純化，從而富集到兩色金雞菊總黃酮部位。通過建立UPLC-DAD液相方法，首次測定了兩色金雞菊總黃酮部位的10種主要成分，包括9種黃酮類成分和1種苯丙素類成分。其中，化合物2R/S-異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷是存在R、S兩種構(gòu)型，目前對該化合物進(jìn)行含量測定的，均是測定兩種化合物的總含量[10，15]，故本文測定了2R/S-異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷的兩種化合物構(gòu)型的總含量。儀器精密度、方法重復(fù)性、樣品穩(wěn)定性、線性關(guān)系和加樣回收率等均符合要求，表明所建立的基于UPLC-DAD多成分含量測定方法能夠滿足兩色金雞菊總黃酮主要成分的含量測定。

使用DAD紫外檢測器對供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，比較供試品溶液在285、378、275 nm下的色譜圖數(shù)據(jù)，結(jié)果表明在285、378 nm波長下，基線平穩(wěn)、出峰數(shù)多，色譜峰響應(yīng)值較高，其中化合物3、5、6、7、8、10在378 nm下分離度及色譜峰響應(yīng)值較高，故最終選用285、378 nm作為檢測波長。供試品提取采用80%甲醇超聲提取40 min，發(fā)現(xiàn)供試品溶液呈棕褐色、透明狀，表明此方法提取率較高。

目前有關(guān)兩色金雞菊單體成分的研究集中于黃酮類成分，如馬里苷[16-17]、奧卡寧[18]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，益母草胰島素增敏部位含有苯丙酸類化合物[19]，這表明，除了黃酮類成分，苯丙素類化合物也有可能是兩色金雞菊改善胰島素抵抗的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。故而，本實(shí)驗(yàn)對兩色金雞菊的9種黃酮類成分及1種苯丙素成分建立了質(zhì)量控制方法，為進(jìn)一步藥效物質(zhì)的研究提供了理論依據(jù)。