王嘉婧，趙云龍，潘冠霖，王爽，鄭榮欣

（吉林省通化師范學(xué)院 通化市 134000）

長久以來，植食性昆蟲與植物的相互作用關(guān)系是科研領(lǐng)域中特別活躍的領(lǐng)域，國內(nèi)外諸多學(xué)者對(duì)其給予了極大的關(guān)注。目前，諸多學(xué)者從形態(tài)、行為、生理、生化、分子等方面對(duì)植物的防御反應(yīng)和昆蟲的適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了探究討論。保護(hù)酶和解毒酶作為昆蟲體內(nèi)兩類重要的酶系，對(duì)于維持昆蟲體內(nèi)正常的生理生化代謝、分解有毒物質(zhì)方面具有十分重要的作用，因此常被用來作為生物體內(nèi)生理狀態(tài)改變的度量指標(biāo)[1-3]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是昆蟲體內(nèi)十分重要的保護(hù)酶，使昆蟲免受自由基傷害，增強(qiáng)昆蟲的免疫能力，保護(hù)昆蟲體內(nèi)的細(xì)胞遠(yuǎn)離不利環(huán)境的影響。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（gl%utathione-S-transferase，GSTs）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholin esterase，AchE）對(duì)于昆蟲體內(nèi)的解毒代謝有十分重要的作用。植物在昆蟲為害的過程中產(chǎn)生的次生性代謝物可以使昆蟲體內(nèi)解毒酶的活性發(fā)生改變，有利于昆蟲對(duì)植物次生物質(zhì)產(chǎn)生適應(yīng)性。本文選擇初始寄生在蕓豆和豌豆上的朱砂葉螨，將其轉(zhuǎn)移到新的寄主蕓豆上檢測為害后32 h內(nèi)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)其體內(nèi)酶活性的變化。研究朱砂葉螨對(duì)寄主防御機(jī)制的適應(yīng)策略有利于加深對(duì)兩者間協(xié)同進(jìn)化關(guān)系的認(rèn)識(shí)，對(duì)治理朱砂葉螨和培養(yǎng)抗蟲植株有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 昆蟲與供食植物

朱砂葉螨：初始蟲源于7月采自通化師范學(xué)院溫室大棚草莓植株上，經(jīng)鑒定后，在人工氣候室內(nèi)（25±1℃，相對(duì)濕度70%，光周期13L：11D）分別用新鮮蕓豆、豌豆飼養(yǎng)純化3代以上備用，兩種寄主飼養(yǎng)的朱砂葉螨不可混合。

蕓豆、豌豆：盆栽，長出真葉時(shí)待用。

實(shí)驗(yàn)用螨：分別將寄主為蕓豆、豌豆飼養(yǎng)純化3代以上的朱砂葉螨所產(chǎn)的卵置于新鮮蕓豆、豌豆上，待一周左右長為成蟲后供實(shí)驗(yàn)用。

1.2 處理方法

在健康蕓豆上接初始寄主為蕓豆的成螨，每株100頭，取食至4 h、8 h、16 h、32 h取樣50頭，每處理重復(fù)3次。

在健康蕓豆上接初始寄主為豌豆的成螨，每株100頭，取食至4 h、8 h、16 h、32 h取樣50頭，每處理重復(fù)3次。

1.3 酶的提取與活性測定

酶液制備：取50頭成螨放入2.0 mL離心管中，加入100 mL冷的生理鹽水在冰盒上用玻璃研磨棒研磨，再加200 mL生理鹽水沖洗研磨棒。在4℃條件下以4 000 r/min離心15 min，實(shí)驗(yàn)酶液取離心上清液。

蛋白質(zhì)濃度測定：采用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行測定[4]。

酶活性的測定：SOD和GSTs、AChE活力的測定均使用南京建成生物工程研究所所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。寄主轉(zhuǎn)換對(duì)酶活性的影響采用單因素方差分析，采用Duncan法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 保護(hù)酶SOD活性變化

當(dāng)初始寄主為蕓豆時(shí)，取食為害新的蕓豆4 h、8 h、16 h體內(nèi)SOD的酶活性變化差異不顯著，而當(dāng)初始寄主為豌豆時(shí)，取食為害8 h、16 h時(shí)螨體內(nèi)SOD活性顯著低于4 h，隨著為害時(shí)間的延長，32 h時(shí)兩種寄主植物螨體內(nèi)的酶活力均顯著高于其他幾個(gè)時(shí)間的酶活力，SOD酶活力變化趨勢均呈先下降后上升，而且可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)寄主植物為豌豆時(shí)，同一取食時(shí)間下蟲體內(nèi)中SOD的酶活性均顯著或極顯著高于寄主植物為蕓豆時(shí)的酶活性（圖1）。

圖1 朱砂葉螨體內(nèi)SOD酶活性變化

2.2 解毒酶GSTs和AchE活性變化

2.2.1 GSTs

初始寄主為蕓豆時(shí)，朱砂葉螨取食為害新的蕓豆其體內(nèi)酶活力變化呈先下降后上升趨勢，其中8 h、16 h后體內(nèi)的GSTs活性顯著低于取食4 h時(shí)的活性，而取食為害32 h后體內(nèi)的GSTs活性均顯著高于4 h、8 h和16 h。初始寄主為豌豆的朱砂葉螨取食為害蕓豆體內(nèi)酶活力變化則呈先上升后下降趨勢，8 h、16 h后體內(nèi)的GSTs活性顯著高于取食4 h的GSTs活性；取食為害32 h時(shí)的酶活性則顯著降低，而且當(dāng)寄主植物為豌豆時(shí)，在一定時(shí)間內(nèi)，可以發(fā)現(xiàn)GSTs活性在任意時(shí)間下均高于寄主植物為蕓豆時(shí)的活性，除了32 h差異顯著外，其余時(shí)間差異均極顯著（圖2）。

圖2 朱砂葉螨體內(nèi)GSTs酶活性變化

2.2.2AchE

初始寄主為蕓豆時(shí)，朱砂葉螨取食為害新的蕓豆8 h、16 h、32 h的AchE活性比4 h時(shí)顯著下降，AchE酶活性變化總體呈先下降后上升趨勢。初始寄主為豌豆時(shí)，蟲體AchE活性在8 h是顯著下降；16 h時(shí)又顯著上升，但仍顯著低于取食為害4 h時(shí)的活性；取食為害時(shí)間達(dá)到32 h時(shí)，朱砂葉螨體內(nèi)的AchE活性均顯著高于其他幾個(gè)時(shí)間段的AchE活性，活性的變化整體均呈先下降后上升的趨勢。初始寄主為蕓豆的朱砂葉螨在各個(gè)取食時(shí)間體內(nèi)的酶活力皆顯著高于初始寄主為豌豆的朱砂葉螨，其中4 h和8 h差異極顯著（圖3）。

圖3 朱砂葉螨體內(nèi)AchE酶活性變化

3 討論

3.1 朱砂葉螨體內(nèi)保護(hù)酶SOD在寄主適應(yīng)性中的作用

SOD在動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)普遍存在，是一種金屬酶，對(duì)生物體內(nèi)的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它不僅可以清除超氧陰離子自由基OH-，而且能夠使細(xì)胞免受傷害[5]。SOD可通過歧化反應(yīng)使超氧陰離子自由基歧化為H2O2，進(jìn)一步被其余保護(hù)酶（CAT和POD等酶）作用分解[6]。本研究發(fā)現(xiàn)兩種寄主植物螨體內(nèi)的SOD酶活力總體呈先下降后上升趨勢，這可能是朱砂葉螨在為害寄主短時(shí)間內(nèi)，寄主的保護(hù)機(jī)制還未及時(shí)對(duì)朱砂葉螨做出反應(yīng)，寄主產(chǎn)生的次生代謝物少，對(duì)朱砂葉螨影響小，所以先下降。隨著為害時(shí)間的延長，寄主產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物增多，對(duì)朱砂葉螨的影響變大，為了應(yīng)對(duì)這種不利情況，朱砂葉螨體內(nèi)的SOD酶活性又上升。已接觸的寄主相比未接觸過的寄主，螨體內(nèi)的適應(yīng)機(jī)制相對(duì)完善，寄主產(chǎn)生的此生代謝產(chǎn)物影響小，所以初始寄主為豌豆的朱砂葉螨在為害的各個(gè)時(shí)間體內(nèi)的SOD活力高于初始寄主為蕓豆的。

3.2 朱砂葉螨體內(nèi)解毒酶GSTs、AchE在寄主適應(yīng)性中的作用

昆蟲通過體內(nèi)解毒酶系對(duì)寄主植物產(chǎn)生的次生性物質(zhì)進(jìn)行解毒和排毒，對(duì)維持正常生理代謝方面起重要作用[2，7-8]。

谷胱甘肽（glutathione，GSH）可和親電類物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，是一類三肽硫醇構(gòu)成的親核物質(zhì)。GSTs與GSH催化結(jié)合后，GSH的pKa從9.0降至6.0～7.0，使其能與更多親電試劑發(fā)生作用，最終形成低毒、易溶于水的化合物而從體內(nèi)排出，減少或避免對(duì)生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)等親核物質(zhì)的破壞[9-10]。GSTs功能多樣，主要包括參與內(nèi)源、外源有毒物質(zhì)的解毒代謝，保護(hù)細(xì)胞免受氧脅迫造成損傷，參與物質(zhì)合成，調(diào)節(jié)信號(hào)通路，使昆蟲抗藥性產(chǎn)生[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，初始寄主為蕓豆時(shí)的朱砂葉螨在取食為害過程中的GSTs總體變化趨勢呈先降低后上升趨勢，而初始寄主為豌豆時(shí)螨體內(nèi)的酶活性變化呈先上升后下降的趨勢，而且后者的酶活力在各個(gè)為害時(shí)間都要高于前者，這可能是由于面對(duì)植物的防御，朱砂葉螨已經(jīng)接觸過的植物，面對(duì)它產(chǎn)生的次生代謝物具有相對(duì)完善的適應(yīng)機(jī)制，更能引起體內(nèi)GSTs的快速應(yīng)對(duì)，但是隨著為害時(shí)間的延長，蕓豆所產(chǎn)生的次生代謝物對(duì)朱砂葉螨的作用效果逐漸降低，所以初始寄主為蕓豆的朱砂葉螨體內(nèi)的GSTs活性變化呈先上升后下降趨勢；而朱砂葉螨對(duì)未接觸的植物適應(yīng)機(jī)制不完善，在為害短時(shí)間內(nèi)對(duì)螨體內(nèi)的GSTs誘導(dǎo)表達(dá)量少，但是隨著為害時(shí)間的延長，蕓豆植株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物增加，對(duì)朱砂葉螨的不利影響變大，為了適應(yīng)這種不利影響，螨體內(nèi)適應(yīng)機(jī)制逐漸完善，所以GSTs活性呈先上升后下降趨勢。從整體上看，初始寄主為蕓豆的朱砂葉螨比初始寄主為豌豆螨體內(nèi)的GSTs更容易被誘導(dǎo)。

乙酰膽堿酯酶在生物神經(jīng)傳導(dǎo)中起著十分重要的作用，能夠快速水解興奮性神經(jīng)遞質(zhì)以保證神經(jīng)突觸傳導(dǎo)的正常進(jìn)行，如果AchE被抑制，昆蟲可能會(huì)因?yàn)檫^度興奮而死亡[12]。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種寄主的朱砂葉螨體內(nèi)AchE變化趨勢相同，而且隨著為害時(shí)間的延長，初始寄主為蕓豆、豌豆的朱砂葉螨體內(nèi)酶活性變化趨勢均呈先下降后上升趨勢，這可能是面對(duì)寄主植物所帶來的刺激，螨體內(nèi)的AchE受到一定程度的抑制，對(duì)蕓豆防御過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生興奮，但是過度的興奮容易導(dǎo)致死亡，所以朱砂葉螨對(duì)蕓豆所帶來的刺激產(chǎn)生快速應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)體內(nèi)AchE合成，降低興奮性，所以螨體內(nèi)的AchE均呈先下降后上升趨勢。但是初始寄主為豌豆的朱砂葉螨體內(nèi)的酶活性要低于初始寄主為蕓豆的朱砂葉螨，可見未接觸的植物更能引起朱砂葉螨的興奮。朱砂葉螨取食為害蕓豆后體內(nèi)AchE活性變化趨勢與寄主為豌豆時(shí)的GSTs活性變化趨勢正相反，這可能是AchE和GSTs的功能差異所導(dǎo)致，AchE的主要功能是水解興奮性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿以確保神經(jīng)突觸傳導(dǎo)的正常進(jìn)行，但GSTs主要是對(duì)內(nèi)源、外源的有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒代謝，保護(hù)細(xì)胞免受氧脅迫造成損傷等。

綜上所述，雖然朱砂葉螨對(duì)于寄主植物脅迫都有快速應(yīng)激反應(yīng)，通過保護(hù)酶和解毒酶活性的誘導(dǎo)表達(dá)，達(dá)到螨體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡，但朱砂葉螨在同種寄主之間和不同種寄主間轉(zhuǎn)換的生理適應(yīng)性存在差異。本研究初步探討了朱砂葉螨為害寄主植物產(chǎn)生的次生物質(zhì)對(duì)體內(nèi)保護(hù)酶SOD和解毒酶GSTs、AchE的影響。對(duì)螨體內(nèi)的酶系影響，由于昆蟲體內(nèi)存在著多種保護(hù)酶和解毒酶系，功能錯(cuò)綜復(fù)雜，其活性變化與寄主植物體內(nèi)的營養(yǎng)、次生物質(zhì)的含量和種類有關(guān)，還與害蟲的種類、發(fā)育階段相關(guān)，可能還受外界環(huán)境等因素的影響[13]。影響朱砂葉螨體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性的因素中，到底是何種因素占主導(dǎo)作用還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。