孔 帥，陳 敏，鄭美娟，許鵬飛，呂育財(cái)，謝 飛，周宜平，龔大春*

（1.三峽大學(xué) 湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002；

2.宜昌三峽制藥有限公司，湖北 宜昌 443002）

L-異亮氨酸是人體8種必需氨基酸之一，同時(shí)又是3種支鏈氨基酸之一，因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，在生命代謝中具有重要作用[1]，已被廣泛應(yīng)用于食品、動(dòng)物飼料和醫(yī)藥等行業(yè)[2]。L-異亮氨酸的生產(chǎn)方法主要有水解法、化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法。生物發(fā)酵法因其原料成本低、易于控制、節(jié)能環(huán)保成為工業(yè)化生產(chǎn)的首選方法。但是，目前國內(nèi)L-異亮氨酸的生產(chǎn)效率不高，與國外有較大差距，其中高產(chǎn)菌株的缺乏已成為發(fā)酵法制備L-異亮氨酸的技術(shù)瓶頸之一[3-6]。

常溫常壓等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種技術(shù)是一種微生物基因組快速突變技術(shù)[7-9]。該技術(shù)具有成本低、操作簡便、安全性、等離子體產(chǎn)生條件溫和、富含大量活性粒子、突變譜廣、突變率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于細(xì)菌、真菌、微藻等微生物的生物育種[10-14]。高產(chǎn)L-異亮氨酸菌株的篩選方法是當(dāng)前ARTP誘變育種的研究重點(diǎn)。在L-異亮氨酸的合成途徑中，天冬氨酸對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶存在著反饋抑制作用，若解除該反饋抑制能使代謝流更加通暢，從而增加L-異亮氨酸的產(chǎn)量[15-20]?；前冯沂翘於彼岬慕Y(jié)構(gòu)類似物，如果將磺胺胍加入培養(yǎng)基中用于菌株的篩選，期望得到磺胺胍抗性突變株，有效解除天冬氨酸對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反饋抑制，使天冬氨酸大量合成，從而提高L-異亮氨酸產(chǎn)量。在得到突變庫的基礎(chǔ)上，利用茚三酮與氨基酸的顯色反應(yīng)可以結(jié)合多功能酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)多孔板的高通量篩選。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用ARTP誘變儀對(duì)谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）23798進(jìn)行誘變，然后采用適宜濃度的磺胺胍抗性標(biāo)記進(jìn)行初篩，再利用氨基酸與茚三酮顯色反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行高通量篩選，最后通過發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)篩，以期得到高產(chǎn)L-異亮氨酸的誘變谷氨酸棒桿菌，并對(duì)其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為后續(xù)的發(fā)酵放大培養(yǎng)優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum）23798：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

1.1.2 試劑

氯化鈉、硫酸銨、磷酸氫二鈉苯（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；L-異亮氨酸、茚三酮、乙醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、牛肉浸粉（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，牛肉浸粉3g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉浸粉3 g/L，磷酸氫二鈉1 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨7 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉浸粉3 g/L，磷酸氫二鈉1 g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨6 g/L，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基葡萄糖單獨(dú)滅菌，滅菌條件均為1×105Pa滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP-M常溫常壓等離子體誘變育種儀：無錫源清天木生物科技有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；ZQRY-180S恒溫?fù)u床：上海知楚儀器有限公司；SP-Max 2300A光吸收型全波長酶標(biāo)儀：上海閃譜生物科技有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Leopard70-2A微孔板恒溫振蕩器：萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；MX-307落地高速冷凍離心機(jī)：日本TOMY公司；UV-1800分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；XW-80A旋渦混合儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；L-8900氨基酸分析儀：日本天美科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及培養(yǎng)

將保存的谷氨酸棒桿菌23798劃線接種于活化培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)3 d；將平板上的菌種刮取一環(huán)接種到100 mL種子培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16 h，將種子液制成OD600nm值為0.7的菌懸液，加入5%甘油，備用。

1.3.2 菌株的ARTP誘變時(shí)間的考察[21]

將ARTP的溫度保持在20℃，調(diào)節(jié)功率為120 W，氦氣（He）流量為10 L/min。吸取10 μL菌懸液于無菌金屬載片上，將載片放入誘變室內(nèi)，發(fā)射源距離菌液2 mm，采用不同的時(shí)間（0 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s）對(duì)菌液進(jìn)行誘變處理。將誘變的菌體接入1 mL生理鹽水中振搖1min，取100μL涂布到活化培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2d，計(jì)算致死率，確定最佳誘變時(shí)間，其計(jì)算公式如下：

1.3.3 誘變篩選抗性標(biāo)記磺胺胍濃度的考察

將無菌磺胺胍加入50mL活化培養(yǎng)基中，使磺胺胍最終質(zhì)量濃度分別為0、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL。將100μL種子菌懸液涂布于含磺胺胍的抗性平板上，37℃培養(yǎng)2 d，觀察菌體生長情況，確定誘變菌株抗性標(biāo)記所采用的最佳磺胺胍質(zhì)量濃度。

1.3.4 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的篩選

以谷氨酸棒桿菌23798為出發(fā)菌株，在最佳誘變時(shí)間條件下進(jìn)行ARTP誘變，涂布到含有最佳磺胺胍質(zhì)量濃度的抗性標(biāo)記平板上，37℃培養(yǎng)2 d。挑選生長快速、單菌落較大的菌株，用竹簽將平板上誘變的菌株接種到含1 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng)48 h后，離心，取上清液20 μL至96圓孔深孔板中，每個(gè)孔板加入240 μL 0.5%的茚三酮溶液，70℃水浴8 min，然后冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀測定波長570 nm處的吸光度值（OD570nm值），挑選出OD570nm值較大的菌株，采用薄層層析-分光光度法[22]和氨基酸分析儀[23-24]進(jìn)行定性定量。通過搖瓶復(fù)篩，取上清液，利用氨基酸分析儀檢測其L-異亮氨酸含量[24]，獲得高產(chǎn)L-異亮氨酸的谷氨酸棒桿菌誘變菌株。

1.3.5 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株發(fā)酵培養(yǎng)

將原始菌株和篩選得到的高產(chǎn)L-異亮氨酸的誘變菌株分別接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16 h；按10%（V/V）的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，利用氨基酸分析儀測定其L-異亮氨酸含量。

1.3.6 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將誘變菌株在活化培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10次，再進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用氨基酸分析儀檢測菌株的L-異亮氨酸產(chǎn)量，研究其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳誘變時(shí)間的確定

等離子體中的活性粒子作用于微生物，能夠使微生物細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生顯著變化，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生突變。誘變時(shí)間和作用強(qiáng)度對(duì)微生物致死率的影響較大，致死率過低或過高都不利于篩選。因此，在不同誘變時(shí)間下，考察誘變時(shí)間對(duì)谷氨酸棒桿菌致死率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 谷氨酸棒桿菌ARTP誘變致死率曲線Fig.1 Curve of lethallty rate forCorynebacterium glutamicumbyARTP mutagenesis

從圖1可以看出，ARTP對(duì)Corynebacterium glutamicum的殺傷力較大，當(dāng)誘變時(shí)間為60～120 s時(shí)，該菌株致死率呈直線增長，且當(dāng)誘變時(shí)間為120s時(shí)，菌株致死率達(dá)到88%左右；當(dāng)誘變時(shí)間為180 s時(shí)，菌株致死率達(dá)到98.44%；當(dāng)誘變時(shí)間為240 s時(shí)，菌株致死率接近100%。為了保證一定的突變率，選擇相應(yīng)的誘變時(shí)間至關(guān)重要。因此，選擇致死率達(dá)到98.44%的180 s為最佳誘變時(shí)間。

2.2 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的抗性篩選

磺胺胍為天冬氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，通過選育磺胺胍抗性突變株能遺傳性地解決天冬氨酸對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反饋抑制[19]。研究發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度的磺胺胍對(duì)細(xì)胞的抑制程度不同，因此，需要優(yōu)化磺胺胍質(zhì)量濃度，使篩選效果達(dá)到最佳。不同磺胺胍質(zhì)量濃度對(duì)Coryne bacterium glutamicum的抑制率如圖2所示。

圖2 不同質(zhì)量濃度磺胺胍對(duì)谷氨酸棒桿菌生長的影響Fig.2 Effect of different sulfaguanidine contents on the growth of Corynebacterium glutamicum

從圖2可以看出，磺胺胍對(duì)Corynebacteriumglutamicum的抑制效果明顯。當(dāng)磺胺胍質(zhì)量濃度＜0.1mg/mL之前，抑制作用較小；當(dāng)磺胺胍質(zhì)量濃度達(dá)到0.3mg/mL時(shí)，抑制效果增強(qiáng)，抑制率達(dá)到97%左右；當(dāng)磺胺胍質(zhì)量濃度達(dá)到0.4mg/mL時(shí)，菌體不能生長，故選取質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的磺胺胍進(jìn)行抗性標(biāo)記篩選。

采用ARTP誘變儀對(duì)谷氨酸棒桿菌菌懸液誘變180 s，將誘變的菌體涂布于含有0.4 mg/mL磺胺胍的活化培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2 d，從中篩選獲得菌落生長快、菌落大的42個(gè)單菌落，編號(hào)為A1～A6、B1～B6、C1～C6、D1～D6、E1～E6、F1～F6、G1～G6。

2.3 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的高通量篩選

挑選菌落較大的42個(gè)單菌落于24孔板培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，以原始菌株吸光強(qiáng)度為1.0，測定樣品的相對(duì)吸光度值，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同誘變菌株的相對(duì)吸光強(qiáng)度Fig.3 Relative absorbance intensity of different mutants

由圖3可知，大多數(shù)誘變菌株的相對(duì)吸光度值高于原始菌株，且其中3株誘變菌株B1、D6、E5的相對(duì)吸光度值高于原始菌株的20%以上，通過薄層層析-分光光度法和氨基酸分析儀對(duì)這3株誘變菌株的發(fā)酵上清液中的L-異亮氨酸進(jìn)行定性、定量，進(jìn)一步確認(rèn)3株誘變菌株L-異亮酸產(chǎn)量高于原始菌株。因此，對(duì)誘變菌株B1、D6、E5進(jìn)行搖瓶復(fù)篩驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.4 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩

將誘變菌株B1、D6、E5和原始菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，利用氨基酸分析儀檢測發(fā)酵48 h時(shí)的L-異亮氨酸產(chǎn)量，結(jié)果如表1所示。

表1 誘變菌株的L-異亮氨酸Table 1 L-isoleucine production of mutants

由表1可以看出，與原始菌株相比，誘變菌株B1、D6、E5具有較好的L-異亮氨酸生產(chǎn)性能，其產(chǎn)量分別增加62.03%、30.89%、14.19%，其中誘變菌株B1的L-異亮氨酸生產(chǎn)能力最高。由此可見，本實(shí)驗(yàn)的篩選方法是行之有效的。

2.5 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

為了檢驗(yàn)誘變菌株B1能否保持穩(wěn)定的遺傳特性，將誘變菌株B1連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，并同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用氨基酸分析儀對(duì)發(fā)酵上清液中L-異亮氨酸的產(chǎn)量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，從第1代到第10代，誘變菌株B1的L-異亮氨酸產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定，可見該誘變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖4 誘變菌株B1的遺傳穩(wěn)定性Fig.4 Genetic stability of mutant strain B1

3 結(jié)論

從原始菌株Corynebacterium glutamicum23798出發(fā)，經(jīng)過ARTP誘變處理180 s后，涂布于含0.4 mg/mL磺胺胍培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 d，挑選出菌落較大的菌株，接種至24孔板液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用氨基酸與茚三酮的特異性反應(yīng)與相對(duì)應(yīng)的菌株發(fā)酵上清液進(jìn)行96孔酶標(biāo)儀高通量篩選，選育出一株高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變Corynebacterium glutamicumB1。該菌株搖瓶發(fā)酵48 h后，L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)18.5 g/L，較原始菌株提高62.03%，且遺傳性狀穩(wěn)定。該研究通過將ARTP隨機(jī)誘變與磺胺胍定向抑制微生物產(chǎn)酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶相結(jié)合，增大誘變菌株向L-異亮氨酸積累方向突變的幾率，提高優(yōu)良菌株的篩選效率，為產(chǎn)L-異亮氨酸菌株的選育提供了高效的篩選方法，為其他高產(chǎn)氨基酸菌株的篩選提供重要參考。