吳啟鳳，李紅梅，楊勝涵，曹海鵬*

（貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001）

水晶葡萄色澤綠黃、皮薄汁多、酸甜適口，有濃郁的狐香味，且可溶性固形物含量＞15%，是品質(zhì)優(yōu)良的葡萄品種。與其他葡萄品種相比，水晶葡萄還具有抗病性強(qiáng)、耐貧瘠、易管理及豐產(chǎn)性好等優(yōu)點(diǎn)，特別適合山區(qū)種植。目前，水晶葡萄已成為貴州地區(qū)的主要栽培品種，種植面積約占貴州總葡萄種植面積的60%，廣泛分布于貴州各個(gè)地區(qū)，規(guī)模化種植越來(lái)越多。然而水晶葡萄產(chǎn)業(yè)存在單一品種種植面積過(guò)大、經(jīng)濟(jì)附加值低、產(chǎn)品不宜貯存、缺乏大型的葡萄存貯及加工企業(yè)等問(wèn)題[1]，給葡萄種植帶來(lái)一定的滯銷風(fēng)險(xiǎn)，在一定程度上影響了農(nóng)戶的種植積極性和產(chǎn)業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。因此，大力推廣水晶葡萄的深加工勢(shì)在必行。

將新鮮的水晶葡萄用于葡萄酒釀制，可降低水晶葡萄產(chǎn)業(yè)過(guò)剩、產(chǎn)品滯銷、易腐敗等風(fēng)險(xiǎn)，提高產(chǎn)品附加值，推動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，帶動(dòng)當(dāng)?shù)厝罕娋蜆I(yè)，符合貴州綠色經(jīng)濟(jì)發(fā)展的戰(zhàn)略定位。決定水晶葡萄酒品質(zhì)的關(guān)鍵是發(fā)酵用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），選擇適宜的釀酒酵母至關(guān)重要[2-4]。目前，市場(chǎng)上釀酒用的酵母多為進(jìn)口釀酒酵母，其用于國(guó)內(nèi)葡萄酒發(fā)酵不能體現(xiàn)本地葡萄的品質(zhì)和特色，同質(zhì)化現(xiàn)象嚴(yán)重[5-7]。為解決這一困境，近年，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開(kāi)展了當(dāng)?shù)仄咸厌劸平湍傅姆蛛x及釀酒性能研究，以期篩選出適合當(dāng)?shù)仄咸寻l(fā)酵的酵母菌。如湯曉宏等[8-9]以蓬萊葡萄酒產(chǎn)區(qū)君頂酒莊霞多麗的果皮和葡萄園土壤為原料，分離出對(duì)SO2、酒精、高鹽及高糖耐受極強(qiáng)的釀酒酵母PJ16，對(duì)SO2耐受性高達(dá)500 mg/L，對(duì)酒精、高鹽及高糖耐受性分別達(dá)12%vol、2.8 mol/L和60%；龐紅勛[10]以天津地區(qū)所產(chǎn)的貴人香、玫瑰香和赤霞珠等葡萄為分離材料，篩選出一株釀酒酵母M502，具有生長(zhǎng)繁殖快、發(fā)酵迅速、糖度耐受性強(qiáng)及酒精發(fā)酵度高等特點(diǎn)；高曉航[11]以寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的成熟期葡萄果實(shí)、表皮和土壤為原料，分離一株釀酒性能優(yōu)良的釀酒酵母，并通過(guò)誘變育種和原生質(zhì)體融合，選育出一株性能更為優(yōu)良的釀酒酵母菌株R17，其可耐受酒精12%vol、SO2250mg/L、糖30%、NaCl 100 g/L，糖的乙醇轉(zhuǎn)化率為88.92%；BELL P J L等[12]以篩選出的野生釀酒酵母YS2為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)馴化后，菌株的糖轉(zhuǎn)化率提高20%以上。以上研究表明，以本地葡萄為原料，經(jīng)分離篩選可以得到釀酒性能優(yōu)良的酵母菌株。

因此，本研究以貴州三都縣所產(chǎn)水晶葡萄為原料，利用其葡萄汁自然發(fā)酵，經(jīng)分離篩選、耐受性及釀酒性能研究，篩選優(yōu)良的釀酒酵母，并通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，以期篩選出能夠適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境和葡萄原料的優(yōu)良釀酒酵母。1材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

水晶葡萄：采摘于貴州三都縣葡萄園區(qū)。

1.1.2 試劑

LA-PE果酒酵母：煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；2×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）mix、Gold-ViewTM：全式金生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

WL固體培養(yǎng)基[13]：酵母浸粉4.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，氯化鉀0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，瓊脂20 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，氯化鐵0.002 5 g/L，硫酸錳0.002 5 g/L，溴甲酚綠22 mg/L，pH 6.5。121℃高壓滅菌20 min。

模擬葡萄汁培養(yǎng)基[13]：葡萄糖200 g/L，硫酸銅0.05 g/L，蛋白胨10 g/L，檸檬酸3 g/L，酵母浸粉5 g/L，121℃高壓滅菌20 min。按需要加入SO2、調(diào)整pH。

1.2 儀器與設(shè)備

DH6000B電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-1G超凈工作臺(tái)：上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海洪旋實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；WD-9402B/D非醫(yī)用基因擴(kuò)增儀：北京六一生物科技有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母的分離

取新采摘的水晶葡萄約100 g，去梗粉碎后裝入250 mL錐形瓶中，并加入60 mg/L的SO2混勻，置于室溫條件下靜置發(fā)酵。至錐形瓶底部沉降大量白色沉淀且有大量氣泡生成時(shí)，取底部沉淀液1 mL進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取200 μL10-5、10-6、10-7梯度稀釋液均勻涂布于WL固體培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d。挑取WL平板上圓隆、邊緣整齊、稠厚、不透明、乳白色或略帶綠色的疑似菌落，轉(zhuǎn)接于WL斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，編號(hào)，鏡檢，并保藏。

1.3.2 優(yōu)良釀酒酵母的初篩

挑取少量上述斜面培養(yǎng)種子，轉(zhuǎn)接于4 mL模擬葡萄汁培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。取1%液體種子，轉(zhuǎn)接入10 mL含杜氏小管的模擬葡萄汁培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)2 d，每株菌設(shè)定3個(gè)平行。期間記錄各菌株的產(chǎn)氣起始時(shí)間[13]、凝聚性能[13-14]、杜氏管充滿氣體時(shí)間[13-15]及發(fā)酵高峰持續(xù)時(shí)間[8]。將能在2 d內(nèi)絮凝并產(chǎn)氣充滿杜氏管的菌株保藏，進(jìn)行耐受性試驗(yàn)[13-16]。

1.3.3 優(yōu)良釀酒酵母耐受性的測(cè)定

將初篩得到的菌株制備成模擬葡萄汁液體種子（約8.7×108CFU/mL），按1%（V/V）的接種量依次接種于不同糖濃度（10%、20%、30%、40%、50%及60%）、不同乙醇含量（10%vol、12%vol、14%vol、16%vol及18%vol）、不同SO2質(zhì)量濃度（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L及300 mg/L）的模擬葡萄汁中，pH值控制在2.0，裝液量為20 mL/50 mL試管，28℃靜置培養(yǎng)2 d，期間記錄酵母菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)氣狀況，有大量白色沉淀形成的表明生長(zhǎng)旺盛，沉淀形成不明顯的則采用菌落計(jì)數(shù)法觀察，觀察培養(yǎng)前后菌體數(shù)量變化。反應(yīng)結(jié)束后各取200μL發(fā)酵液均勻涂布于WL固體培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)2 d，觀察各菌株在WL固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況[6]。綜合評(píng)價(jià)分離菌株的耐受性，逐步篩選出糖、低pH值、酒精及SO2耐受性較高的優(yōu)良釀酒酵母菌株[13]。

1.3.4 優(yōu)良釀酒酵母的分子生物學(xué)鑒定

挑取斜面上的優(yōu)良酵母菌種劃線于WL平板，28℃靜置培養(yǎng)36 h。以平板培養(yǎng)的單菌落為模板，酵母5.8S rDNA通用引物NL1和NL4為上下游引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10 μ mol/L NL1 1 μL，10 μmol/L NL4 1 μL，2×PCR mix 25 μL，雙蒸水（dd H2O）23 μL，無(wú)菌吸頭沾取少許單菌落，混勻。PCR擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，并將PCR反應(yīng)液提交至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將5.8S rDNA測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并采用 MEGA 7.0軟件的鄰近法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析并確定酵母種類。

1.3.5 優(yōu)良釀酒酵母的釀酒性能分析

將復(fù)篩得到的優(yōu)良菌株和法國(guó)進(jìn)口的LA-PE白葡萄酒釀酒酵母分別接種于100mL/250mL模擬葡萄汁培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)48h制備液體種子。收集各發(fā)酵液，8000r/min離心2 min，棄上清液，沉淀用生理鹽水洗滌3次，最后懸浮于10mL生理鹽水中。將各菌種按1.0×108CFU/mL的濃度分別接種于7 L的水晶葡萄汁中（糖度用白砂糖調(diào)至25°Bx，pH用酒石酸調(diào)至3.3，SO2質(zhì)量濃度為60 mg/L），裝入10 L玻璃壇中水封發(fā)酵20d至產(chǎn)氣結(jié)束。期間記錄各壇產(chǎn)氣時(shí)間、菌體絮凝時(shí)間、主發(fā)酵持續(xù)時(shí)間等。然后對(duì)酒液過(guò)濾，于5L玻璃壇中滿壇陳釀30 d。參照周一琴等[17]的方法檢測(cè)葡萄酒的澄清度、色澤。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》檢測(cè)各菌株發(fā)酵酒液的色度（OD520nm值）、酒精度、殘?zhí)?、總酸及揮發(fā)酸的含量[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母的分離結(jié)果

葡萄發(fā)酵液經(jīng)梯度稀釋和WL固體平板分離，共挑選出18株疑似釀酒酵母，編號(hào)為SJJM-1～SJJM-18。所有酵母菌菌落均呈乳白色（少數(shù)帶淺綠色），生長(zhǎng)前期，菌落圓隆光滑、后期高凸，稠厚不透明，酒香味明顯，具有典型的釀酒酵母形態(tài)特征。其中菌株SJJM-7的菌落和細(xì)胞形態(tài)特征見(jiàn)圖1。

圖1 菌株SJJM-7的菌落（a）和細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony(a)and cell(b)morphology of strain SJJM-7

2.2 優(yōu)良釀酒酵母的初篩

經(jīng)杜氏管產(chǎn)氣試驗(yàn)，檢測(cè)各菌株的產(chǎn)氣起始時(shí)間、杜氏管滿氣時(shí)間及菌體凝集性，并記錄產(chǎn)氣高峰持續(xù)時(shí)間，結(jié)果如表1所示。由表1可知，菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-6、SJJM-7、SJJM-9、SJJM-10、SJJM-11、SJJM-17、SJJM-18凝聚性能最好，均在培養(yǎng)9 h內(nèi)開(kāi)始凝聚，并迅速在管底形成大量白色沉淀；菌株SJJM-7、SJJM-18的產(chǎn)氣時(shí)間最早，培養(yǎng)4 h即開(kāi)始產(chǎn)氣；菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-8、SJJM-10、SJJM-13和SJJM-18的發(fā)酵高峰持續(xù)時(shí)間最久，達(dá)3 d左右；菌株SJJM-7和SJJM-18發(fā)酵最為迅速，在發(fā)酵時(shí)間為16h時(shí)，氣體充滿杜氏小管。結(jié)合各菌株的凝聚性能、產(chǎn)氣起始時(shí)間、小管滿氣時(shí)間及發(fā)酵高峰持續(xù)時(shí)間，選取菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-6、SJJM-7、SJJM-8、SJJM-9、SJJM-10、SJJM-11、SJJM-13、SJJM-17和SJJM-18進(jìn)行耐受性復(fù)篩試驗(yàn)。

表1 分離菌株的初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening result of isolated strains

2.3 優(yōu)良釀酒酵母復(fù)篩結(jié)果

2.3.1 糖耐受性試驗(yàn)結(jié)果

表2 分離菌株的糖耐受性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Sugar tolerance test results of isolated strains

初篩菌株的糖耐受性試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知，所有菌株在含20%糖培養(yǎng)基中均能正常發(fā)酵，菌體數(shù)量增長(zhǎng)明顯；當(dāng)糖含量增加至40%時(shí)，各菌株發(fā)酵產(chǎn)氣速度迅速下降，菌體數(shù)量增長(zhǎng)緩慢；當(dāng)糖含量為60%時(shí)，只有菌株SJJM-7、SJJM-9、SJJM-10和SJJM-18能夠發(fā)酵產(chǎn)氣，但產(chǎn)氣速率非常低，菌體數(shù)量變化不明顯，其他菌株菌體濃度下降。與劉暢[18]報(bào)道的釀酒酵母只能耐受50%以下的糖含量相比，菌株SJJM-7、SJJM-9、SJJM-10和SJJM-18具有較高的糖耐受性。

2.3.2 pH耐受性試驗(yàn)結(jié)果

初篩菌株在pH為2.0的模擬葡萄汁培養(yǎng)基中的存活率如表3所示。由表3可知，初始菌株在pH 2.0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后，菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-7、SJJM-9及SJJM-18的存活率均＞20%。與湯曉宏等[9]報(bào)道的葡萄酒野生釀酒酵母可耐受pH 2.5相比，這些菌株對(duì)較強(qiáng)酸性環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，結(jié)合糖耐受性試驗(yàn)結(jié)果，選取菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-7、SJJM-9及SJJM-18進(jìn)行乙醇耐受性試驗(yàn)。

表3 分離菌株的pH耐性性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 pH tolerance test results of isolated strains

2.3.3 乙醇耐受性試驗(yàn)結(jié)果

將菌株SJJM-2、SJJM-5、SJJM-7、SJJM-9及SJJM-18的液體種子分別接種于不同乙醇濃度（10%vol、12%vol、14%vol、16%vol和18%vol）的模擬葡萄汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，觀察菌種的生長(zhǎng)和產(chǎn)氣情況，結(jié)果如表4所示。由表4可知，所有菌株均能在乙醇含量為10%vol的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、發(fā)酵產(chǎn)氣；當(dāng)乙醇濃度為12%vol時(shí)，所有菌株發(fā)酵產(chǎn)氣均明顯減弱，其中菌株SJJM-5停止發(fā)酵產(chǎn)氣，菌體數(shù)量減少；乙醇濃度為14%vol時(shí)，除菌株SJJM-18少量產(chǎn)氣外，其余菌株均停止發(fā)酵產(chǎn)氣，菌體濃度降低明顯；當(dāng)乙醇濃度增加到16%vol時(shí)，所有菌株均停止產(chǎn)氣，菌體濃度急劇減少甚至完全檢測(cè)不到。與湯曉宏等[9，19]報(bào)道的野生釀酒酵母的乙醇耐受性相比，這些菌株的乙醇耐受性較低，滿足釀造要求還有一定的差距，后期可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步馴化和培育，使其滿足釀造較高酒精度葡萄酒的條件。

表4 分離菌株的乙醇耐受性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Ethanol tolerance test results of isolated strains

2.3.4 SO2耐受性試驗(yàn)結(jié)果

由乙醇耐受性試驗(yàn)結(jié)果可知，菌株SJJM-2、SJJM-7和SJJM-18有較強(qiáng)的乙醇耐受性，因此，對(duì)這3株菌株的SO2耐受性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表5所示。由表5可知，3株菌對(duì)SO2均有較高的耐受性，在SO2含量為200mg/L的培養(yǎng)基中仍能保持微弱的發(fā)酵和生長(zhǎng)。其中，菌株SJJM-7對(duì)SO2的耐受性最強(qiáng)，能在SO2含量為300 mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，且能產(chǎn)生少量氣泡。

表5 分離菌株的SO2耐受性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 SO2tolerance test results of isolated strains

結(jié)合初篩和耐受性試驗(yàn)結(jié)果可知，菌株SJJM-7和SJJM-18具良好的凝聚性、較早的發(fā)酵產(chǎn)氣時(shí)間、較強(qiáng)的產(chǎn)氣能力和較強(qiáng)的耐受性，為優(yōu)良釀酒酵母，在葡萄酒發(fā)酵應(yīng)用中具有一定潛力。

2.4 優(yōu)良釀酒酵母的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以菌株SJJM-7和SJJM-18的單菌落為模板，以引物NL1和NL4為上下游引物，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，菌株SJJM-7和SJJM-18的5.8S rDNA序列與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YLL20等菌株的相似性＞99%。選取同源性較高的模式菌株的5.8S rDNA序列，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，菌株SJJM-7和SJJM-18與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合菌株在WL培養(yǎng)基中的菌落特征，鑒定菌株SJJM-7和SJJM-18均為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖2 基于5.8S rDNA序列菌株SJJM-7和SJJM-18的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain SJJM-7 and SJJM-18 based on 5.8S rDNA sequences

2.5 優(yōu)良釀酒酵母釀酒性能試驗(yàn)結(jié)果

將菌株SJJM-7、SJJM-18及LA-PE分別接種于水晶葡萄汁中，經(jīng)20 d主發(fā)酵、30 d陳釀后，檢測(cè)葡萄酒的澄清度、色度、色澤、酒精度、殘?zhí)?、總酸及揮發(fā)酸的含量，結(jié)果如表6所示。由表6可知，菌株SJJM-7、SJJM-18發(fā)酵的葡萄酒在澄清度、揮發(fā)酸、殘?zhí)呛考熬凭鹊确矫鎯?yōu)于菌株LA-PE，更適合本地的水晶葡萄酒的釀制。菌株SJJM-7、SJJM-18發(fā)酵的葡萄酒的揮發(fā)酸、殘?zhí)橇?、酒精度均符合GB 15037—2006《葡萄酒》（揮發(fā)酸≤1.2g/L；殘?zhí)橇俊?.0 g/L；酒精度≥7.0%vol）要求。SJJM-7和SJJM-18組的殘?zhí)橇烤?.0 g/L，適合釀制干白葡萄酒（殘?zhí)橇俊?.0 g/L）。

表6 優(yōu)良釀酒酵母釀酒性能的測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of enological characteristics for excellentSaccharomyces cerevisiae

3 結(jié)論

本研究以貴州省所產(chǎn)的水晶葡萄為原料，分離篩選出兩株性能優(yōu)良的酵母，分別命名為SJJM-7和SJJM-18。兩株酵母均具有良好的凝聚性，發(fā)酵啟動(dòng)早，產(chǎn)氣速度快且發(fā)酵高峰持續(xù)時(shí)間久。耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株SJJM-7和SJJM-18均能耐受50%的高糖模擬葡萄汁培養(yǎng)基；能耐受pH為2.0的模擬葡萄汁培養(yǎng)基，發(fā)酵2 d后菌體存活率均＞20%；乙醇耐受性強(qiáng)，能耐受12%vol的乙醇；能耐受高濃度的SO2，其中菌株SJJM-7能在含300 mg/L SO2的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、產(chǎn)氣。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后，這兩株菌均被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。利用這兩株菌株發(fā)酵水晶葡萄汁后，菌株SJJM-7和SJJM-18的釀酒性能優(yōu)于進(jìn)口商品酵母菌株LA-PE。結(jié)果表明，菌株SJJM-7和SJJM-18在生產(chǎn)水晶葡萄酒方面具有一定的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。