劉延波，邢星月，趙志軍，劉 寧，潘春梅，孫西玉，3*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院（酒業(yè)學(xué)院），河南 鄭州 450046；

2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；

3.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 寧陵 476733）

河南的張弓老酒是北方濃香型“黃淮酒”的代表之一，以濃香、味醇而聞名；其風(fēng)格既有北方濃香型白酒醇厚豐滿、綿柔爽凈的共性，也有低度酒獨(dú)特的低而不淡，高度酒高而不暴的特性[1]。大曲是大曲酒生產(chǎn)釀造所需的重要物質(zhì)，是釀酒生產(chǎn)過(guò)程中的糖化、發(fā)酵、酒化和生香劑[2]。大曲酶系主要由糖化酶、液化酶、脂肪酶等組成，釀酒的出酒率和成品酒的質(zhì)量與這些酶系有著很大的關(guān)系[3-4]。

脂肪酶是一類?；饷?，主要水解甘油和不同長(zhǎng)度的脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯[5]。脂肪酶在白酒制曲和發(fā)酵期間，可以水解原料中所含的脂肪，使淀粉充分接觸酵母，促進(jìn)發(fā)酵代謝進(jìn)程；同時(shí)產(chǎn)生有機(jī)酸和甘油，有機(jī)酸可使酒出現(xiàn)甜味和回甜感，甘油可以增加白酒的醇和度；脂肪酶同時(shí)還可以催化有機(jī)酸與大量存在的乙醇生成乙酸乙酯、己酸乙酯等酯類香味物質(zhì)[6]，提高白酒中酯類香味物質(zhì)的含量，明顯提高優(yōu)質(zhì)酒品率[7]。

關(guān)于脂肪酶的研究大部分研究是從富含油脂的土壤或污水中篩選出高產(chǎn)脂肪酶的菌株[8]，而從白酒大曲中篩選高產(chǎn)脂肪酶菌株的研究較少，且較少涉及產(chǎn)酶條件優(yōu)化。本研究從張弓老酒大曲中分離篩選出產(chǎn)脂肪酶活力較高的菌株，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，為提高白酒出酒率和改善白酒品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：張弓老酒大曲。

篩選培養(yǎng)基[9]：添加1%的三丁酸甘油酯和0.05%的羅丹明B（篩選培養(yǎng)基于121℃滅菌30 min）的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

液體種子培養(yǎng)基[9]：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：酵母膏0.5%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO40.2%，NaCl 0.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，橄欖油2%（V/V），pH7.0。

羅丹明B（分析純）、三丁酸甘油酯（分析純）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：天根生化科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LQZ-211恒溫培養(yǎng)搖床：上海知楚儀器有限公司；DNP-9272BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZX-50KBS立式高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：方科儀器（常州）有限公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶產(chǎn)生菌的分離

無(wú)菌條件下稱取5 g樣品放入盛有45 mL無(wú)菌水的三角瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）放入搖床，室溫條件下180 r/min振蕩打散30 min后取出靜置30 min[11]，制成1∶10的均勻稀釋液。吸取1 mL菌懸液，注入含有9 mL無(wú)菌水的試管內(nèi)，振搖試管20 s使管內(nèi)溶液混勻，制成1∶100的稀釋液，同樣方法配制成稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6菌懸液。各取0.1 mL涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，倒置，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h[9]。觀察菌落周圍有無(wú)透明圈出現(xiàn)，將有透明圈產(chǎn)生的菌落挑出并純化至純種，于4℃冰箱斜面保存。

1.3.2脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

（1）脂肪酶產(chǎn)生菌的初篩

將斜面上的菌株接種于篩選培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24～72 h。記錄產(chǎn)透明圈的菌株，通過(guò)比較透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）的比值，初步判斷產(chǎn)酶活力大小[12]。

（2）脂肪酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩

挑取培養(yǎng)成熟的菌種于液體種子培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h，按2%（V/V）的接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 h。取一定量的發(fā)酵液到離心管中，4℃、8 000 r/min條件下離心10 min，離心后取上清液即為粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定[13]，進(jìn)一步確定高產(chǎn)菌株。

（3）脂肪酶活力測(cè)定

將培養(yǎng)24 h的菌液依據(jù)GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》進(jìn)行測(cè)定：將40 g/L的聚乙烯醇溶液與橄欖油以3∶1（V/V）混合，超聲處理6 min[14]，制成乳白色的聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）乳化液，即為底物溶液。取該底物溶液4 mL，磷酸緩沖鹽溶液5 mL，構(gòu)成反應(yīng)體系，于40℃水浴中預(yù)熱5 min后加入1 mL粗酶液，立即混勻計(jì)時(shí)，繼續(xù)保溫反應(yīng)15 min后，加入15 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇終止反應(yīng)。空白對(duì)照則在加入15 mL 95%乙醇后進(jìn)行預(yù)熱處理，然后加入粗酶液反應(yīng)15 min。之后采用0.05 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴定酶作用后的底物溶液和空白對(duì)照，根據(jù)消耗的堿量計(jì)算其酶活力。

脂肪酶酶活單位定義為：在pH7.5，40℃條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol可滴定脂肪酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.3 產(chǎn)脂肪酶菌株的鑒定

（1）菌落形態(tài)與生理生化特征

對(duì)篩選的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和革蘭氏染色，進(jìn)行初步鑒定，生理生化試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。

（2）菌株的分子生物學(xué)鑒定

16S rDNA序列分析[16]：采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取分離菌株的DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的模板。采用通用引物27F（5′-AGAGTTTCATCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增細(xì)菌基因組DNA中的16S rDNA基因。PCR擴(kuò)增體系：5 μL 10×buffer、4 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）、3 μL模板DNA、0.25 μLTaqDNA聚合酶（5 U/L）、1 μL引物（10 mmol/L），補(bǔ)充無(wú)菌超純水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性45 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR過(guò)程中陰性對(duì)照以去離子水為模板。取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)量和特異性，將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所得到的特定序列，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上通過(guò)BLAST程序進(jìn)行同源性比較與分析。

1.3.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化[17-19]

（1）單因素試驗(yàn)

以搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別考察不同接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、不同碳源（蔗糖、葡萄糖、糊精、可溶性淀粉）及碳源含量（1%、2%、3%、4%、5%）、不同氮源（蛋白胨、豆粕粉、酵母浸粉、尿素）及氮源含量（1%、2%、3%、4%、5%）、不同初始pH值（5、6、7、8、9）對(duì)脂肪酶活力的影響，每組各做3個(gè)平行，菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中于37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后將發(fā)酵液以4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定脂肪酶活力。

（2）響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取3個(gè)相關(guān)影響因素，以酶活力為因變量，利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，確定高產(chǎn)脂肪酶菌株的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)組合并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)[20-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的分離和篩選

通過(guò)羅丹明B平板法從張弓老酒大曲中篩選了266株產(chǎn)脂肪酶的菌株。經(jīng)過(guò)初篩（透明圈與菌落直徑之比≥3.0）得到了12株產(chǎn)脂肪酶能力較好的菌株，進(jìn)一步檢測(cè)其產(chǎn)酶活力，測(cè)定結(jié)果如表1所示。由表1可知，菌株E-11的酶活最高為12.25 U/mL，后續(xù)試驗(yàn)將選取產(chǎn)脂肪酶能力最強(qiáng)的菌株E-11為目的菌株。

表1 產(chǎn)脂肪酶菌株篩選結(jié)果Table 1 Screening results of lipase-producing strains

2.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)與生理生化特征

菌株E-11在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上37℃培養(yǎng)48 h，E-11菌落呈白色，前期表面光滑，后期表面粗糙有隆起、褶皺，邊緣不整齊，具腥臭味。其細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。由圖1可知，細(xì)胞呈桿狀，是革蘭氏陽(yáng)性（G＋）菌。菌株E-11的生理生化特征如表2，根據(jù)形態(tài)和生理生化特征，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[25]可初步確定菌株E-11屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。2.2.2分子生物學(xué)鑒定

圖1 菌株E-11的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of strain E-11

表2 菌株E-11的生理生化檢測(cè)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical determination results of strain E-11

以E-11菌株的DNA為模板，PCR擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因，得到的序列堿基長(zhǎng)約1490bp。經(jīng)Blast分析，與GenBank中BacillussubtilisDP12 HQ536001.1的同源性為99%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株E-11與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合生理生化試驗(yàn)可確定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2 菌株E-11基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain E-11 based on 16S rDNA sequences

2.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 產(chǎn)脂肪酶條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

（1）不同接種量對(duì)脂肪酶活力的影響

不同接種量對(duì)脂肪酶活力的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，接種量＜2%之前，隨著接種量的增加脂肪酶活力不斷升高，接種量為2%時(shí)，酶活力最高，達(dá)到11.38 U/mL，接種量＞2%之后，隨著接種量的增加，酶活力不斷降低。因此，該菌發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)最佳接種量為2%。

圖3 不同接種量對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.3 Effect of different inoculum on lipase activity

（2）不同碳源及最適碳源添加量對(duì)脂肪酶活力的影響

不同碳源對(duì)脂肪酶活力的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，以葡萄糖為碳源時(shí)，酶活力最高，達(dá)到12.98 U/mL。表明葡萄糖是最佳碳源。以葡萄糖作為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵，不同葡萄糖添加量對(duì)脂肪酶活力的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著葡萄糖添加量的增加，脂肪酶活力也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。當(dāng)葡萄糖添加量為3%時(shí)，脂肪酶的酶活力達(dá)到最高為10.8 U/mL。當(dāng)葡萄糖添加量繼續(xù)增加時(shí)，酶活力呈下降趨勢(shì)。因此，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)最佳葡萄糖添加量為3%。

圖4 不同碳源對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on lipase activity

圖5 不同葡萄糖添加量對(duì)脂肪酶活力影響Fig.5 Effect of different glucose concentration on lipase activity

（3）不同氮源及最適氮源添加量對(duì)脂肪酶活力的影響

不同氮源對(duì)脂肪酶活力的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，以蛋白胨為氮源時(shí)，酶活力最高，達(dá)到12.34 U/mL。表明蛋白胨是最佳氮源。以蛋白胨作為唯一氮源進(jìn)行發(fā)酵，不同蛋白胨添加量對(duì)脂肪酶活力的影響見(jiàn)圖7。由圖7可知，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?%～4%時(shí)，隨著蛋白胨添加量的增加，脂肪酶活力也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?%時(shí)，脂肪酶的酶活力達(dá)到最高為13.23 U/mL。當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿坷^續(xù)增加時(shí)，酶活力呈下降趨勢(shì)。因此，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)最佳蛋白胨添加量為4%。

圖6 不同氮源對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.6 Effect of different nitrogen sources on lipase activity

圖7 不同蛋白胨含量對(duì)脂肪酶活力影響Fig.7 Effect of peptone concentration on lipase activity

（4）不同初始pH值對(duì)脂肪酶活力的影響

不同初始pH值對(duì)脂肪酶活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，當(dāng)初始pH值＜8之前，隨著初始pH值逐漸升高，酶活力也呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值為8時(shí)，酶活力最高，達(dá)到11.60 U/mL，當(dāng)初始pH值繼續(xù)升高時(shí)，酶活力開始下降。表明最佳初始pH值為8。

圖8 不同初始pH值對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.8 Effect of different initial pH on lipase activity

2.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以脂肪酶酶活（Y）作為響應(yīng)值，選取葡萄糖含量、蛋白胨含量、初始pH值三個(gè)具有顯著影響的因素作為自變量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。采用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到酶活對(duì)自變量葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、初始pH值的多元回歸方程為：

Y=-449.083 25+19.018 50A+29.095 50B+94.081 00C-0.702 50AB-0.56250AC+0.147 50BC-1.892 25A2-3.432 25B2-5.847 25C2

回歸方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、初始pH值以及這三個(gè)因素之間的交互作用都對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），A2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），B2和C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），整個(gè)模型極顯著，回歸模型F值為9.85，且顯著性檢驗(yàn)為極顯著（P=0.003 2），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.580 9＞0.05），說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合良好。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology

回歸方程決定系數(shù)（R2）=0.926 8，表明92.68%的酶活變化可由此模型解釋，與實(shí)際情況擬合良好。該方程為菌株E-11發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶提供了一個(gè)合適的模型，因此可用上述模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)脂肪酶發(fā)酵進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

（2）各因素交互作用的響應(yīng)面圖

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)二次響應(yīng)面回歸模型做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面，結(jié)果見(jiàn)圖9。由回歸模型繪制的響應(yīng)面圖（圖9）所示，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)為A=2.662，B=3.692，C=8.505，對(duì)應(yīng)的實(shí)際取值為A=3，B=4，C=8。并根據(jù)實(shí)際操作條件優(yōu)化，得最佳發(fā)酵條件為葡萄糖含量3%，蛋白胨含量4%，初始pH值8，在此條件下理論預(yù)測(cè)最大酶活為13.62 U/mL，實(shí)際值為15.09 U/mL。與預(yù)測(cè)值基本接近，說(shuō)明所建模型擬合良好且可靠。3結(jié)論

圖9 各因素交互作用對(duì)脂肪酶活力影響的響應(yīng)面和等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on lipase activity

本研究通過(guò)羅丹明B平板法和脂肪酶活力測(cè)定從張弓老酒大曲中分離篩選出一株脂肪酶高產(chǎn)菌E-11，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），通過(guò)單因素和響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的最佳產(chǎn)酶條件為：葡萄糖添加量3%，蛋白胨添加量4%，初始pH值為8。本研究將響應(yīng)面分析法應(yīng)用到脂肪酶發(fā)酵的優(yōu)化過(guò)程中，并且得到了較好的結(jié)果。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了脂肪酶酶活的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。優(yōu)化后的脂肪酶活力達(dá)15.09 U/mL，是優(yōu)化前產(chǎn)酶能力的1.2倍。并對(duì)該優(yōu)化條件進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證，與響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果相符，說(shuō)明該模型穩(wěn)定可行，且此方法具有實(shí)用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。本研究首次從張弓老酒大曲中分離得到產(chǎn)脂肪酶較高的枯草芽孢桿菌，為提高脂肪酶產(chǎn)量進(jìn)而增香酒品提供了理論依據(jù)。