趙正濤 蘭海靜 李全陽

（廣西大學(xué)輕工與食品學(xué)院 南寧530004）

酪蛋白是牛奶中最重要的成分， 它主要是以酪蛋白膠束的形式均勻分布在牛奶體系中。 雖然對酪蛋白膠束的內(nèi)部結(jié)構(gòu)仍有爭議， 但目前最被認(rèn)可的模型仍為納米團(tuán)簇模型[1]。 在這個(gè)模型中，αs-和β-酪蛋白通過膠體磷酸鈣連接形成內(nèi)部結(jié)構(gòu)，κ-酪蛋白存在于酪蛋白膠束表面，提供靜電和位阻排斥作用來保證膠體穩(wěn)定性[2-3]。

牛奶凝膠結(jié)構(gòu)的形成是奶酪及酸乳等產(chǎn)品的前提條件。 要想形成凝膠，則必須要克服κ-酪蛋白固有的斥力作用。在乳制品生產(chǎn)過程中，兩種最常見的方法是降低體系的pH 值和加入凝乳酶。凝乳酶是牛胃中發(fā)現(xiàn)的一種天門冬氨酸蛋白酶，它可專一性地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之間的肽鍵，釋放糖巨肽到乳清中，糖巨肽帶負(fù)電荷并且提供空間作用[4]。糖巨肽的解離導(dǎo)致酪蛋白膠束之間的斥力降低， 當(dāng)85%到90%的糖巨肽被解離的時(shí)候， 酪蛋白通過疏水作用和鈣離子的橋聯(lián)作用結(jié)合在一起，形成凝膠結(jié)構(gòu)[5-7]。

凝乳酶凝膠形成可以分為兩個(gè)過程， 第1 步是糖巨肽的產(chǎn)生釋放， 第2 步是酪蛋白膠束的聚集及凝膠結(jié)構(gòu)的形成[4]。凝乳酶和酪蛋白的結(jié)合受多種因素的影響。比如，加熱過程中變性的乳清蛋白會結(jié)合在酪蛋白膠束的表面， 從而降低酶的作用效果并延長凝乳時(shí)間[8]。人們還發(fā)現(xiàn)降低牛奶的pH 會促進(jìn)凝乳酶和κ-酪蛋白的結(jié)合， 從而加速凝膠過程[9]。此外，研究表明，牛乳乳清組成有時(shí)候也能夠顯著影響酶凝膠結(jié)構(gòu)的形成， 牛奶中添加酪蛋白酸鈉會抑制酶凝膠結(jié)構(gòu)的形成[10]，然而這是否源自酪蛋白酸鈉影響凝乳酶的活性或者酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的解離仍不清楚。另一些情況下，采用超濾技術(shù)對牛奶進(jìn)行濃縮， 增加乳清蛋白的含量并未影響酶凝膠結(jié)構(gòu)的形成過程[11-12]。 除此之外，牛乳乳清的離子組成成分對凝膠過程也有著顯著的影響，添加鈉離子會降低糖巨肽的解離速度，凝膠結(jié)構(gòu)的形成必須有充足的鈣離子才能實(shí)現(xiàn)[13]。

酪蛋白凝膠的質(zhì)量直接關(guān)系奶酪和酸乳制品的質(zhì)量，深入探索其相互作用機(jī)制具有重要意義。前述研究絕大部分原料采用復(fù)原乳， 在影響作用機(jī)理方面也存在探討的余地， 進(jìn)一步深入了解乳清組分對酶凝膠結(jié)構(gòu)的形成機(jī)理仍有必要。

本文首先通過濃縮技術(shù)改變?nèi)榍褰M成， 研究它對酪蛋白膠束特性的影響。 采用流變儀和擴(kuò)散光譜相結(jié)合的方法動(dòng)態(tài)分析不同樣品的凝膠結(jié)構(gòu)的形成過程， 闡述牛乳乳清蛋白質(zhì)和離子對酶凝膠結(jié)構(gòu)形成的機(jī)理，為乳品企業(yè)改善酸乳、奶酪產(chǎn)品的質(zhì)量提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫巴氏奶購買于加拿大當(dāng)?shù)氐奈譅柆敵?，凝乳酶購買于美國丹尼斯克公司。所有的化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FP-528 杜馬斯氮含量分析儀， 美國Leco 公司；Optima TM LE-80K 超速離心機(jī)， 美國Beckman 公司；861 高級離子色譜分析儀， 瑞士Metrohm 公司；動(dòng)態(tài)光散射儀，英國Malvern 儀器公司；AR-1000 流變儀，美國TA 儀器公司；擴(kuò)散光譜，加拿大圭爾夫大學(xué)食品學(xué)院。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛奶的濃縮及不同組分乳清樣品的制備牛奶采用超濾膜（10ku）進(jìn)行超濾并濃縮至2 倍（V/V），此過程能保留牛奶中所有的蛋白質(zhì)，所分離的滲透液僅含離子相及分子質(zhì)量小于10ku 的小分子物質(zhì)。

為制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪蛋白酸鈉溶液，稱取1g 酪蛋白酸鈉并溶解在所分離的牛奶滲透液中攪拌至充分溶解。 乳清相的分離采用對牛奶進(jìn)行高速離心的方法，分離條件為100 000 g，1 h。同超濾膜所得到的滲透液相比， 分離的乳清相中含大量的乳清蛋白（含量約為1%）。將準(zhǔn)備好的不同溶液按照體積比1∶1 的比例同所得到的濃縮奶混合并充分?jǐn)嚢杌靹?，最后得到的檢測樣品如下：對照組：濃縮奶+滲透液；樣品1：濃縮奶+去離子水；樣品2：濃縮奶+含1%酪蛋白酸鈉的滲透液；樣品3：濃縮奶+乳清相。

1.3.2 乳清和滲透液的分離 乳清相的分離采用超速離心法， 所分離的乳清相中的蛋白質(zhì)和鈣定義為可溶性蛋白質(zhì)和鈣。 為進(jìn)一步除掉乳清中的蛋白質(zhì)，乳清相用裝有超濾膜（10 ku）的離心管進(jìn)行離心分離得到滲透液。 滲透液中的鈣被定義為可滲透鈣。

1.3.3 蛋白質(zhì)的測定 采用Dumas 燃燒法對牛奶中的總蛋白和可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行測定， 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)為6.38。

1.3.4 鈣的測定 將0.5 mL 牛奶樣品或乳清相放入Pyrex 試管中，置于馬弗爐中，95 ℃加熱6 h，然后500 ℃加熱8 h。所得到的灰分加入0.5 mL 1 mol/L 的硝酸進(jìn)行溶解， 并加水稀釋到100 倍，然后用離子色譜進(jìn)行鈣濃度測定。具體的測定條件，請參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.5 粒度分布和Zeta 電位的測定 不同的牛奶樣品用其相應(yīng)的滲透液稀釋至1 000 倍， 然后用動(dòng)態(tài)光散射儀和Zeta 電位儀進(jìn)行測定。

1.3.6 凝乳酶凝膠 牛乳樣品采用水浴鍋加熱并保持在30 ℃， 然后加入0.031 IMCU/mL 的凝乳酶。凝乳過程采用流變儀和擴(kuò)散光譜進(jìn)行研究。關(guān)于擴(kuò)散光譜的原理及作用機(jī)理請參考文獻(xiàn)[4]。

流變儀的測定采用小振幅振動(dòng)流變進(jìn)行（應(yīng)變0.01， 頻率1Hz）， 凝膠點(diǎn)被定義為彈性模量（G′）超過黏性模量（G″）的點(diǎn)。此外，凝膠過程中濁度（1/l*）的變化及表觀粒徑的變化采用擴(kuò)散光譜進(jìn)行檢測， 具體的測量和計(jì)算方法見參考文獻(xiàn)[4，15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣品的pH、 鈣含量和蛋白質(zhì)含量的測量結(jié)果

表1 的結(jié)果顯示， 各樣品之間pH 值無顯著差異，均為6.70 左右。 對照樣品同添加去離子水的樣品具有相同的總蛋白質(zhì)含量， 而添加了酪蛋白酸鈉和乳清的樣品具有較高的總蛋白質(zhì)含量3.50%左右。本研究測量的對照樣品的總鈣含量為（1 212±52）mg/L，這同以往的報(bào)道相一致[16]。 添加乳清相和酪蛋白酸鈉并未顯著增加樣品的總鈣含量。 與之相反，添加去離子水后，樣品的總鈣含量顯著降低到（1 082±56）mg/L，這主要是由于可滲透鈣的降低而導(dǎo)致。

為證明推斷， 進(jìn)一步測量了各樣品的可溶性鈣和可滲透性鈣含量，結(jié)果見圖1。 可溶性鈣的含量總是比可滲透鈣的含量高， 這是由于乳清中的蛋白質(zhì)分子也具有結(jié)合鈣的能力。 同對照樣品相比較， 添加酪蛋白酸鈉和乳清的樣品可溶性鈣的含量較高， 但二者具有同對照樣相同的可滲透鈣含量。對于添加去離子水的樣品而言，樣品具有較低的可溶性鈣和可滲透鈣， 可滲透鈣從（339±8）mg/L 降低到（211±3）mg/L。顯而易見，可滲透鈣含量的降低是導(dǎo)致總鈣含量降低的主要原因。

表1 各樣品的pH、總蛋白及總鈣含量Table 1 pH， total protein and total calcium concentration for different samples

圖1 各樣品的可溶性鈣（黑色柱形圖）和可滲透鈣（灰色柱形圖）含量測定結(jié)果Fig.1 Soluble （black bar）and permeable （grey bar）calcium for different samples

2.2 粒度分布和Zeta 電勢

牛奶中酪蛋白膠束的大小和表面電荷的多少是牛奶膠體特性的重要影響因素。 表2 的結(jié)果顯示，對照樣品中酪蛋白膠束的平均直徑值為（163±2）mg/L。 樣品2、3 的結(jié)果顯示乳清相和酪蛋白酸鈉的添加并沒有影響酪蛋白膠束的大小。 樣品1的結(jié)果說明，添加去離子水后，酪蛋白膠束的粒徑顯著降低到（153±1）nm。 對照樣品中的酪蛋白的Zeta 電勢值為（-20.4±1）mV，這與以往的研究結(jié)果相一致[4]。 添加去離子水后，酪蛋白膠束的Zeta電勢值迅速增加到（-33.4±2）mV。 溶液中的離子對酪蛋白表面的負(fù)電荷具有屏蔽效果， 添加去離子水后，乳清中的離子強(qiáng)度顯著降低，從而降低了對酪蛋白膠束表面的負(fù)電荷的屏蔽作用。 酪蛋白表面負(fù)電荷的增加增強(qiáng)了酪蛋白膠束間的靜電排斥作用，進(jìn)而導(dǎo)致了酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的收縮。

圖2 顯示了不同樣品的粒度分析圖。 樣品2的粒度分布圖和對照樣品完全重疊（看不到黑色三角形標(biāo)識和曲線），因此認(rèn)為添加乳清相對酪蛋白的粒度分布無影響。以往的報(bào)道顯示，牛奶中添加酪蛋白酸鈉會導(dǎo)致酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的破壞和解離[17]。 但本研究結(jié)果顯示，酪蛋白酸鈉的添加并未影響酪蛋白膠束的粒度分布和表面的電荷。 這可能是由于添加量或添加方式的不同所導(dǎo)致。 另一方面， 去離子水的添加顯著降低了酪蛋白膠束的粒度分布，峰高值向更小的粒徑值方向移動(dòng)。因此本研究發(fā)現(xiàn)， 乳清相中蛋白質(zhì)的增加對酪蛋白的結(jié)構(gòu)無顯著影響， 而離子強(qiáng)度的降低能夠增加酪蛋白表面的電荷并降低酪蛋白膠束的粒徑。

表2 各樣品中酪蛋白的平均粒徑和Zeta 電勢測量結(jié)果Table 2 Average diameter and Zeta potential for casein micelles in different samples

圖2 不同樣品的酪蛋白膠束粒度分布圖Fig.2 Size distributions for casein micelles in different samples

2.3 各樣品酶凝膠特性的測定結(jié)果

本研究采用流變學(xué)特性和光學(xué)特性相結(jié)合的方法對樣品的凝乳酶凝膠過程進(jìn)行了研究。 流變儀可以測量牛乳凝膠的過程及所形成的凝膠結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度。 另一方面，擴(kuò)散光譜不僅能夠測定凝膠結(jié)構(gòu)的形成，并能對酪蛋白的平均粒徑變化及酪蛋白膠束的凝集過程進(jìn)行更加細(xì)微的研究，因而二者的結(jié)合能夠進(jìn)一步幫助我們研究乳清相中的蛋白質(zhì)組成及鈣含量在凝膠結(jié)構(gòu)形成過程中的作用詳情。

2.3.1 流變學(xué)特性 圖3 為各樣品在凝膠過程中彈性模量（G′）及黏性模量（G″）的變化趨勢圖。很顯然，樣品的彈性模量及黏性模量隨著時(shí)間的增加而逐漸增大，黏性模量開始大于彈性模量的點(diǎn)被定義為凝膠點(diǎn)。 此外，tan δ 被定義為黏性模量和彈性模量的比值。 彈性模量的大小可以反映所形成的凝膠結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度大小而tan δ 值可以反映凝膠的柔韌性特性[18]。 表3 總結(jié)了凝膠形成的時(shí)間，凝膠形成45 min 后彈性模量的大小以及所形成的凝膠的tan δ 大小。 對照樣品的凝膠時(shí)間為（62±3）min，添加乳清后，凝膠時(shí)間延長至（71±5）min。 此外，所形成的凝膠強(qiáng)度也從（12±2.0）Pa 降低到（8.5±2.2）Pa。 添加酪蛋白酸鈉阻礙了凝膠結(jié)構(gòu)的形成，整個(gè)測量過程中，黏性模量一直高于彈性模量。 這表明乳清中蛋白質(zhì)含量的增加能夠阻礙酪蛋白凝乳酶凝膠結(jié)構(gòu)的形成。

圖3 不同樣品在凝膠過程中的彈性模量（●）、黏性模量（○）及tan δ（▲）測定結(jié)果Fig.3 Development of elastic modulus （●）， viscous modulus （○）and tanδ（▲）during rennet gelation process for different samples

表3 各樣品的初始濁度值，凝膠時(shí)間，彈性模量以及tan δ 測量結(jié)果Table 3 Initial turbidity， gelation time， elastic modulus and tan δ for different samples

牛奶中添加去離子水后， 鈣離子濃度的降低也顯著阻礙了酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的形成。 凝膠時(shí)間延長到（93±8）min，所形成的凝膠強(qiáng)度僅為（1.5±0.4）Pa。 此外，此時(shí)的tan δ 值為0.3102±0.010，顯著高于其它樣品， 表明這時(shí)所形成的凝膠具有較高的柔韌性和脫水收縮作用。 這可能是由于鈣離子含量的減少， 降低了酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的橋聯(lián)作用所導(dǎo)致。

2.3.2 擴(kuò)散光譜 圖4 顯示了凝膠形成過程中濁度值（A）和平均粒徑（B）的變化趨勢。 同對照樣品和添加乳清的樣品相比， 添加去離子水和酪蛋白酸鈉的樣品具有較高的初始濁度值（表3），這可能是由于此時(shí)樣品中具有較高的蛋白質(zhì)含量。 添加凝乳酶后，所有樣品的濁度值（4A）隨著時(shí)間的增加而逐漸增大，這個(gè)結(jié)果同以往的報(bào)道相一致。濁度值的增加可能是由兩個(gè)原因所導(dǎo)致， 糖巨肽的釋放及酪蛋白分子的聚集。同其它樣品相比較，添加酪蛋白酸鈉的樣品的增加速度較慢。

圖4B 總結(jié)了各樣品在添加凝乳酶后平均粒徑的變化。 在初始的20 min 內(nèi)， 酪蛋白膠束的粒徑輕微降低，這是由于κ-酪蛋白的分解及糖巨肽的釋放所導(dǎo)致[4]。 隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長，對照樣品的粒徑值以最快的速度增加， 然后是添加乳清的樣品及添加去離子水的樣品。 添加酪蛋白酸鈉的樣品的粒徑值并未隨著凝乳時(shí)間的延長而增加，表明無凝膠結(jié)構(gòu)的形成。 報(bào)道表明，酪蛋白間的聚集主要是通過疏水作用和鈣離子的橋聯(lián)作用而形成[4]。 同對照樣品相比較，此時(shí)的樣品具有相同的鈣離子含量。 這表明酪蛋白酸鈉對于凝膠結(jié)構(gòu)的阻礙主要是通過影響酪蛋白膠束間的疏水作用。 添加凝乳酶后，酶會水解κ-酪蛋白并釋放水溶性的糖巨肽， 這會導(dǎo)致酪蛋白膠束表面疏水結(jié)構(gòu)的暴露， 而添加的酪蛋白酸鈉能夠迅速與新暴露的疏水基團(tuán)相結(jié)合，從而形成一層新的覆蓋層，這個(gè)覆蓋層則通過靜電排斥作用和空間位壘作用阻礙酪蛋白膠束的凝集。此外，鈣離子的含量也會顯著影響凝膠結(jié)構(gòu)的形成和凝膠強(qiáng)度。 牛乳中存在足夠的鈣離子（＞330 mg/L）是好的凝膠結(jié)構(gòu)形成的必要條件。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，乳清中的鈣離子含量、蛋白質(zhì)含量及種類都能顯著影響酪蛋白膠束的酶凝集過程。 添加酪蛋白酸鈉和乳清不會對酪蛋白膠束的膠體特性產(chǎn)生影響。 但是乳清中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白酸鈉含量的增加都能顯著降低酪蛋白膠束的凝集過程。同乳清中的主要蛋白質(zhì)β-乳球蛋白和α-乳白蛋白相比，酪蛋白酸鈉具有更強(qiáng)的阻礙酪蛋白膠束聚集的能力。 在酶凝膠的過程中， 糖巨肽的釋放能夠暴露更多的存在于酪蛋白膠束表面的疏水基團(tuán)， 我們認(rèn)為酪蛋白酸鈉分子能通過疏水作用相結(jié)合在酪蛋白膠束表面，從而阻礙凝膠結(jié)構(gòu)的形成。此外，鈣離子濃度的降低也會對酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的形成及特性產(chǎn)生影響。加入去離子水后，牛奶中的鈣離子含量降低了約35%，凝膠時(shí)間從62 min 顯著增加到93 min 且形成的凝膠具有較低的強(qiáng)度（僅為1.5 Pa）。 乳清中足夠含量的鈣離子濃度（＞330 mg/L）是獲得較好凝膠結(jié)構(gòu)的必要條件。顯而易見，通過調(diào)節(jié)牛乳體系中乳清蛋白質(zhì)的含量及鈣離子的強(qiáng)度可有效控制體系凝膠的形成和結(jié)構(gòu)特性。 本研究能夠?qū)δ汤耶a(chǎn)品的生產(chǎn)提供一定的理論和技術(shù)指導(dǎo)。

圖4 不同樣品在凝膠形成過程中濁度值（A）和平均粒徑（B）的變化測定結(jié)果Fig.4 Development of turbidity （A）and average radius （B）during the rennet coagulation process for different samples