段四喜，徐春蓮，湯王外，和壽星*

(1.大理市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，云南 大理 671000；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高山經(jīng)濟(jì)植物研究所，云南 麗江 674100)

蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)川百合的變種，為多年生鱗莖草本植物，有很高的食用、藥用、保健和觀賞價(jià)值[1,2]。采用組織培養(yǎng)進(jìn)行百合的快速培養(yǎng)和脫毒復(fù)壯，可促進(jìn)百合商品種球的生產(chǎn)和百合新品種的培育[3-5]。其中，不定芽誘導(dǎo)的多少是影響植株組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素[5,6]。但是在初代誘導(dǎo)結(jié)束以后，有無不定芽產(chǎn)生會(huì)對蘭州百合繼一代試管苗產(chǎn)生怎樣的影響尚未見報(bào)道。

在蘭州百合組培中往往將組培分為初代、繼代和生根3個(gè)階段[7,8]。其中，繼代培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)過程中的重要環(huán)節(jié)，也是離體保存種質(zhì)資源的重要手段。該階段通常需要連續(xù)多代的培養(yǎng)，在整個(gè)組培過程中占據(jù)的比例大、周期長[9-13]。在此階段如果激素(尤其是NAA和6-BA)濃度過高或者過低，均會(huì)嚴(yán)重影響組培苗的生長發(fā)育；但若兩者濃度和比例適宜，則可實(shí)現(xiàn)外植體的快速繁殖[5,8,14]。在百合繼代培養(yǎng)中NAA和6-BA濃度范圍一般在0.1～1.0 mg/L[14-16]。隨著離體培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種植物組培苗在長期繼代保存過程中增殖能力和生根能力會(huì)發(fā)生變化[10,17,18]，例如：卷丹[11]、東方百合[19]、龍牙百合[20]等繼代培養(yǎng)3次時(shí)組培苗分化和長勢最好，最有利于移栽，之后隨著繼代次數(shù)的增加鱗莖分化率不斷下降；杜捷等[12]發(fā)現(xiàn)蘭州百合繼代培養(yǎng)5次以后無分化能力。但上述學(xué)者都僅局限于研究繼代頻次數(shù)對百合組培苗分化和長勢的影響，并未引入在這一動(dòng)態(tài)過程中激素濃度是否有必要適當(dāng)調(diào)整的研究。截止目前，僅有本課題組就蘭州百合繼一代和繼二代的激素濃度需要適時(shí)調(diào)整做過相關(guān)研究[14]，但在后續(xù)繼代培養(yǎng)過程中，激素濃度是否需要適當(dāng)調(diào)整等并未有相關(guān)研究。因此，如何既能最大限度根據(jù)不同的繼代頻次調(diào)整激素濃度，又可以使組培苗快速健康的生長是目前生產(chǎn)需要解決的關(guān)鍵問題。基于此，本試驗(yàn)的目的一是探討在繼一代組培中初代有無不定芽產(chǎn)生對試管苗生長的影響；二是在最佳繼代次數(shù)3次時(shí)，使NAA和6-BA濃度在0.1～1.0 mg/L范圍內(nèi)，繼續(xù)探討不同繼代次數(shù)激素濃度的調(diào)整對試管苗生長發(fā)育情況的影響，旨在提高蘭州百合再生植株的效率，為種質(zhì)資源的保存奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

于2017年4月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高山經(jīng)濟(jì)植物研究所組培室進(jìn)行鱗片組織培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 材料 蘭州百合鱗莖采集于麗江市龍山鎮(zhèn)，供試材料鱗片保持完好，抱合緊密、健壯、無病斑、色澤光亮、無機(jī)械損傷，鱗莖盤無損壞。

1.2.2 培養(yǎng)條件 先在4 ℃冰箱中保存40 d，之后采用固體MS 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L，pH 值5.8，根據(jù)試驗(yàn)材料添加其他物質(zhì)，121 ℃高壓滅菌25 min。接種后放到培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，日光燈光源，光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間16 h /d。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 初代有無不定芽產(chǎn)生對繼一代生長的影響 在初代接種30 d后，篩選出初代未污染的外植體，設(shè)3個(gè)處理，各處理激素濃度如表1所示，同時(shí)將每個(gè)處理都分為有不定芽產(chǎn)生和無不定芽產(chǎn)生兩處理，每瓶接種4個(gè)點(diǎn)，每處理接種30瓶，重復(fù)3次。接種后15、18、25、28 d觀察并記錄未污染外植體獲得率、轉(zhuǎn)綠率和死亡率。

1.3.2 不同激素濃度對繼一代蘭州百合生長的影響 在初代最優(yōu)培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA中(已有前期結(jié)果[14])，將有不定芽產(chǎn)生的試管苗進(jìn)行切割，每瓶接種4個(gè)點(diǎn)，設(shè)3個(gè)處理，各處理激素濃度如表1所示，每隔一段時(shí)間觀察記錄初代有不定芽產(chǎn)生3個(gè)處理的生葉率、死亡率和小鱗莖個(gè)數(shù)，接種33 d后統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)和小苗株數(shù)。

1.3.3 不同激素濃度對繼二代蘭州百合生長的影響 在繼一代最優(yōu)培養(yǎng)基中，篩選出長勢基本一致的試管苗，剪除葉片，將其進(jìn)行切割，每瓶接種4個(gè)點(diǎn)，接種于繼二代的3個(gè)處理中，各處理激素濃度如表1所示。每隔一段時(shí)間觀察記錄繼二代的發(fā)芽率、生葉率、葉片數(shù)和不定芽個(gè)數(shù)。

1.3.4 不同激素濃度對繼三代蘭州百合生長的影響 在繼二代最優(yōu)培養(yǎng)基中，篩選出長勢基本一致的試管苗，剪除葉片，將其進(jìn)行切割，每瓶接種4個(gè)點(diǎn)，各處理激素濃度分別如表1所示。接種后30 d觀察生葉率、發(fā)芽率、葉片數(shù)和不定芽個(gè)數(shù)，篩選出最適宜的繼三代培養(yǎng)基。

表1 不同繼代次數(shù)的激素濃度 mg/L

1.3.5 相關(guān)計(jì)算公式 未污染外植體獲得率(%)=(未污染外植體個(gè)數(shù)/外植體接種總數(shù))×100%。

外植體存活率(%)=(未污染且存活的個(gè)數(shù)/外植體接種總數(shù)) ×100%。

外植體轉(zhuǎn)綠率(%)=(轉(zhuǎn)綠個(gè)數(shù)/未污染的外植體總數(shù)) ×100%。

外植體發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽的個(gè)數(shù)/未污染的外植體總數(shù)) ×100%。

外植體生葉率(%)=(長葉個(gè)數(shù)/未污染的外植體總數(shù)) ×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代有無不定芽產(chǎn)生對繼一代生長的影響

由圖1～圖3可知，在繼一代培養(yǎng)中，有無不定芽兩處理未污染外植體獲得率、轉(zhuǎn)綠率和死亡率3個(gè)指標(biāo)差異均顯著。有不定芽產(chǎn)生處理的外植體獲得率、轉(zhuǎn)綠率遠(yuǎn)高于無不定芽產(chǎn)生處理，死亡率則遠(yuǎn)低于無不定芽產(chǎn)生處理。在繼一代培養(yǎng)結(jié)束后，無不定芽產(chǎn)生處理3個(gè)激素濃度組合死亡率均為100%，有不定芽產(chǎn)生處理則為A處理死亡率稍高達(dá)到19.02%外，其于兩個(gè)處理死亡率均較低。

在15～28 d范圍內(nèi)，兩處理未污染外植體獲得率變化均較平緩，尤其在繼一代培養(yǎng)的后期(25～28 d)污染率不再增加。就外植體轉(zhuǎn)綠率情況而言，在接種后15～25 d范圍內(nèi)A處理有無不定芽兩處理間無顯著差異，而B和C兩處理間差異顯著，有不定芽產(chǎn)生處理遠(yuǎn)高于無不定芽產(chǎn)生處理，但在接種后期(接種后28 d)差異不顯著。

圖1 初代有無不定芽產(chǎn)生對繼一代未污染外植體獲得率的影響

圖2 初代有無不定芽對繼一代外植體轉(zhuǎn)綠率的影響

圖3 初代有無不定芽對繼一代外植體死亡率的影響

2.2 不同激素濃度對蘭州百合繼一代生長的影響

由表2可知，3個(gè)激素濃度處理間各時(shí)期生葉率、死亡率、小鱗莖個(gè)數(shù)和葉片數(shù)差異顯著，長勢變化幅度較大。就生葉率而言，在接種后13～20 d時(shí)A處理稍強(qiáng)，接種后23～33 d，B處理稍強(qiáng)。在接種后20 d 3個(gè)處理在不同程度上都呈現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡率表現(xiàn)為A>C>B。在接種后13 d 3個(gè)處理間小鱗莖個(gè)數(shù)差異不顯著，接種20～33 d后差異均顯著，為B>A>C；接種33 d后，盡管3個(gè)處理葉片數(shù)間差異不顯著，但是葉片數(shù)以B處理稍多。綜合而言，在繼一代培養(yǎng)中以B處理(MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA)的激素濃度最有利于蘭州百合生長發(fā)育，其次為C處理，而A處理稍差(圖4)。

表2 不同激素濃度對繼一代蘭州百合生長的影響

注：“/”表示此指標(biāo)沒有統(tǒng)計(jì)。下同。

圖4 激素濃度對繼一代苗長勢的影響(接種后20 d)

2.3 不同激素濃度對繼二代蘭州百合組培苗的影響

由圖5可知，試管苗生葉率基本呈現(xiàn)正態(tài)分布，接種后7～17 d生葉率快速增多，17～38 d變化平緩，38～44 d急劇下降。除接種后34 d為A>B>C外，在各階段生葉率均呈現(xiàn)B>A>C。從接種后7 d開始發(fā)芽率不斷的下降，在38～44 d急劇下降，各階段發(fā)芽率均表現(xiàn)為C>A>B。由表3可知，3個(gè)處理葉片數(shù)和不定芽數(shù)有差異但不顯著，除接種后44 d葉片數(shù)和不定芽數(shù)為B稍大于A外，其余均為A>B>C。繼二代蘭州百合培養(yǎng)以A(MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA)為最適培養(yǎng)基，其次為B，而C處理相對較差(圖6)。

表3 不同激素濃度對繼二代蘭州百合生長的影響

2.4 不同激素濃度對繼三代蘭州百合組培苗生長的影響

由表4可知，繼三代各階段生葉率始終遠(yuǎn)高于發(fā)芽率。3個(gè)處理生葉率C最高，發(fā)芽率C最低，生葉率和發(fā)芽率均為C與A和B兩處理差異顯著，而A和B間差異不顯著。各處理葉片數(shù)間差異不顯著。不定芽個(gè)數(shù)除接種后31 d差異顯著，為C>A>B外，其余各階段在接種后不同時(shí)期無顯著差異。繼三代處理6-BA濃度在0.25～0.50 mg/L范圍內(nèi)波動(dòng)時(shí)，A和B兩處理生長發(fā)育情況基本一致，6-BA濃度的變化對百合鱗片的增殖擴(kuò)繁影響甚微。因此，在繼三代培養(yǎng)中以C處理(MS+0.1 mg/L NAA+0.75 mg/L 6-BA)為最適培養(yǎng)基，而A和B處理長勢接近，暫不能區(qū)分何種激素濃度為適宜培養(yǎng)濃度(圖7)。

圖5 激素濃度對繼二代生葉率和發(fā)芽率的影響

圖6 激素濃度對繼二代苗長勢的影響

3 討論與結(jié)論

初代有無不定芽產(chǎn)生與繼一代試管苗存活有很大的關(guān)系，初代培養(yǎng)30 d后，無不定芽產(chǎn)生處理一般可認(rèn)定為死亡[9,21-22]。盡管在繼一代培養(yǎng)中，初代無不定芽產(chǎn)生處理接種后有轉(zhuǎn)綠現(xiàn)象出現(xiàn)，且轉(zhuǎn)綠率在最高時(shí)可達(dá)42.86%，但是在本試驗(yàn)條件下，3種激素濃度處理均不會(huì)再產(chǎn)生不定芽，繼一代培養(yǎng)結(jié)束后(接種后33 d)完全死亡。這進(jìn)一步說明，初代培養(yǎng)30 d左右后，無不定芽產(chǎn)生處理一般可認(rèn)定為死亡。因此，在篩選繼一代培養(yǎng)材料時(shí)，應(yīng)挑選初代已產(chǎn)生不定芽的材料，以提高試管苗的存活率。

表4 不同激素濃度對繼三代蘭州百合生長的影響

圖7 激素濃度對繼三代苗長勢的影響(接種后35 d)

在百合的組織培養(yǎng)研究中已經(jīng)證實(shí)6-BA和NAA濃度水平是百合不定芽能否產(chǎn)生的關(guān)鍵因素[5,8,14]，在其增殖時(shí)對激素濃度也有不同的要求[23]。本課題組前期研究結(jié)果也表明繼一代培養(yǎng)基以MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA為最佳培養(yǎng)基，繼二代以MS+0.1 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA為適宜培養(yǎng)基[14]。但本試驗(yàn)研究結(jié)果表明繼一代和繼二代分別以MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA和MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA為適宜培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)33 d后，最佳繼一代培養(yǎng)基生葉率、小鱗莖數(shù)和葉片數(shù)分別為69.52%、6.67個(gè)和14.50片，但死亡率僅為13.02%；最佳繼二代培養(yǎng)基生葉率、葉片數(shù)和小鱗莖數(shù)在最高時(shí)分別達(dá)到91.18%、21.00片和7.67個(gè)；與前期研究結(jié)果相比，本試驗(yàn)繼一代培養(yǎng)基NAA濃度提高5倍，6-BA濃度卻降低了2倍；繼二代NAA濃度不變，6-BA濃度卻提高2倍。這可能與前期試驗(yàn)均從上一代中篩選長勢一致的試管苗進(jìn)行下一代組培擴(kuò)繁，而本試驗(yàn)在上一代最優(yōu)培養(yǎng)基中篩選出長勢基本一致的試管苗進(jìn)行下一代組織培養(yǎng)有關(guān)。這可能導(dǎo)致植物本身內(nèi)源激素的水平不同，另外內(nèi)源激素又隨植物組織的部位以及生長期等條件而變動(dòng)，從而改變各處理所需的適宜激素水平，這進(jìn)一步說明不同外源植物生長調(diào)節(jié)劑水平顯著影響植物的生長發(fā)育[24,25]，但具體機(jī)理有待于進(jìn)一步研究探討。繼三代培養(yǎng)以MS+0.1 mg/L NAA+0.75 mg/L 6-BA為最佳培養(yǎng)基，生葉率和發(fā)芽率在各階段均為100%和0.00%，而6-BA濃度為0.25、0.50 mg/L的兩處理對不同激素水平表現(xiàn)不敏感，這一方面應(yīng)與繼代后期體細(xì)胞無性系變異有關(guān)，另一方面應(yīng)與激素濃度過低，芽的生長受到抑制有關(guān)[26-28]。