尤奇 段小軍 張駿 金瑛 彭旭 劉毅

1 遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科（貴州遵義563000）

2 陸軍軍醫(yī)大學西南醫(yī)院關(guān)節(jié)外科（重慶400038）

關(guān)節(jié)軟骨是一種沒有血管、神經(jīng)、淋巴系統(tǒng)的結(jié)締組織。關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷很難依靠自身完全修復，而關(guān)節(jié)軟骨損傷后若未能及時有效處理，后期可能導致嚴重后遺癥[1]。目前軟骨缺損的修復方法很多，包括微骨折術(shù)[2]、骨軟骨移植術(shù)[3]、軟骨細胞移植術(shù)[4]以及無細胞支架材料[5-6]等，但由于以上每種方法均有其自身的局限性，尚不能滿足臨床需求。隨著軟骨組織工程的發(fā)展，研究者們積極地尋找能夠修復損傷軟骨組織的種子細胞和支架材料。近年來，人羊膜間充質(zhì)干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，HAMSCs）的研究越來越受到研究者的重視，其取自于廢棄的胎盤，來源廣泛且對人體無額外傷害，也不存在倫理道德爭議。有研究表明HAMSCs增殖能力要強于骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSCs），而且具有高豐度、高純度、低免疫原性等特點[7-9]。1993年日本學者Okano 提出了細胞膜片技術(shù)，該技術(shù)不需要蛋白酶的消化和外源性支架材料，通過細胞外基質(zhì)的分泌形成膜片組織，然后將膜片用于修復組織缺損和改善器官功能，避免了支架材料降解帶來的炎癥反應問題[10]。目前，HAMSCs應用于軟骨損傷修復的研究還相對較少，本研究采用一種簡單的方法構(gòu)建HAMSCs 膜片，并研究其向成軟骨方向分化的潛能以及利用HAMSCs 膜片構(gòu)建組織工程軟骨的可行性，以期為軟骨組織工程提供新的種子細胞，同時為軟骨損傷修復提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

實驗中所收集的7個胎盤均來自于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院產(chǎn)科足月產(chǎn)產(chǎn)婦，無其他基礎疾病，術(shù)前均簽署知情同意書，符合遵義醫(yī)學院倫理委員會要求。

低糖DMEM/F12 培養(yǎng)基（GIBCO，美國）、高糖DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO，美國），Ⅱ型膠原酶（GIBCO，美國）、胰蛋白酶（GIBCO，美國）、FBS（GIBCO 公司，美國）；BFGF（PEPROTECH，美國），TGFβ3（PEPROTECH，美國），地塞米松（SIGMA，美國），維生素C（Solarbio，北京），丙酮酸鈉（Solarbio，北京），胰島素（Solarbio，北京），轉(zhuǎn)鐵蛋白（Solarbio，北京），兔抗人Ⅱ型膠原抗體（abcam，美國），山羊抗兔IGg（中杉金橋，北京），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRPremix EXTaptTM試劑盒（Takara，日本），番紅試劑盒（Solarbio，北京），甲苯胺藍（Sigma，美國），鼠抗人CK-19 單克隆抗體（abcam，美國），鼠抗人波形蛋白單克隆抗體（abcam，美國），山羊抗鼠FITC熒光二抗（Invitrogen，美國），CCK-8 試劑盒（Dojin-do，日本），F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀（Becton Dickinson，美國），實時熒光定量PCR 儀（CFX96，BIO-RAD，美國），酶標儀（SUNRISE，TEC-CAN，奧地利），倒置相差顯微鏡（Nikon，日本），熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本）掃描電鏡（Crossbeam340，德國）。

1.2 HAMSCs提取、培養(yǎng)

將羊膜從胎盤上剝離，PBS 反復沖洗3 次，剪成大小約為1 mm×1 mm×1 mm 的碎片，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化2次，PBS漂洗后，加入0.75 mg/ml Ⅱ型膠原酶，于37℃水浴震蕩消化大約45 分鐘，至肉眼看到只有很小的羊膜碎片為止，300目濾網(wǎng)過濾收集細胞濾液，以1500 rpm 離心6 分鐘。棄上清，用含10%FBS 低糖DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細胞，以1×105個/ml的密度種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天更換1次培養(yǎng)基。

1.3 構(gòu)建HAMSCs膜片以及成軟骨誘導的HAMSCs膜片

取第3代HAMSCs，將細胞以3×105/cm2的密度種植于6孔板中，每孔加入4 ml成膜片培養(yǎng)基（含體積分數(shù)15%FBS，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，10 ng/ml BFGF，50 μg/ml 抗壞血酸，1%雙抗液的低糖DMEMF12 培養(yǎng)基）培養(yǎng)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔兩天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)15天以構(gòu)建HAMSCs膜片。

取第3 代HAMSCs，將細胞以3×105個/cm2的密度種植于6孔板中，每孔加入4 ml成膜片誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天后，換用成軟骨誘導培養(yǎng)基（含10%FBS，TGF-β310 μg/ml，50 mg/ml 抗壞血酸，地塞米松10-7mol/L，1%丙酮酸鈉，6.25 mg/L 胰島素，6.25 mg/L 轉(zhuǎn)鐵蛋白，1%雙抗液的高糖DMEM 培養(yǎng)基）培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔兩天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)15天以構(gòu)建成軟骨誘導的HAMSCs膜片。

1.4 觀測指標

1.4.1 HAMSCs形態(tài)學觀察

倒置相差顯微鏡下觀察原代細胞、P1 代細胞以及傳代后的第3代HAMSCs培養(yǎng)72小時后的細胞大體形態(tài)和生長情況。

1.4.2 HAMSCs的鑒定及純度分析

采用流式細胞術(shù)檢測HAMSCs CD34、CD11B、CD19、CD45、HLA-DR、CD44、CD73、CD90、CD105的表達情況。

1.4.3 HAMSCs波形蛋白和角蛋白19（CK-19）的檢測

利用免疫熒光法檢測HAMSCs 波形蛋白和CK-19的表達情況。

1.4.4 HAMSCs增殖活性檢測

取融合率為85%以上的第3代HAMSCs細胞，消化并制成密度為1×104個/ml的細胞懸液，取100μl加入96孔板中，設置5 個副孔，5 個空白對照組孔。將96 孔板置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，分別向5個副孔和5 個空白對照孔加入10 μl CCK-8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 小時，酶標儀檢測波長為450 nm 處的吸光度值，每24 h 測1 次，以后連續(xù)測10天，每天記錄數(shù)據(jù)并繪制增殖曲線。

1.4.5 HAMSCs膜片細胞形態(tài)學觀察、掃描電鏡檢測以及流式細胞術(shù)檢測

倒置相差顯微鏡下觀察HAMSCs 膜片細胞形態(tài)、分布以及生長情況。②將成膜片誘導15天的HAMSCs用戊二醛固定，掃描電鏡（SEM）觀察膜片的結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)以及細胞外基質(zhì)的分泌。③將成膜片誘導15 天的HAMSCs 進行流式細胞術(shù)檢測，觀察干細胞表型分子CD44、CD73、CD90、CD105的表達情況。

1.4.6 成軟骨誘導HAMSCs 膜片細胞形態(tài)學觀察以及成軟骨相關(guān)分子表達水平檢測

①倒置相差顯微鏡下觀察成軟骨誘導HAMSCs膜片細胞的形態(tài)、分布以及生長情況。②實時熒光定量PCR 檢測：對培養(yǎng)15 天的HAMSCs 膜片和成軟骨誘導的HAMSCs 膜片進行COLⅡ、SOX9、蛋白聚糖（ACAN）mRNA表達水平的檢測。用Trizol提取細胞的RNA，紫外分光光度計檢測RNA 提取量，將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 模板進行熒光定量PCR 檢測。以β-actin 為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計算目標基因相對表達量。引物在NCBI基因庫中進行比對，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。

表1 基因引物序列及產(chǎn)物長度

1.4.7 成軟骨誘導HAMSCs 膜片HE、甲苯胺藍、番紅、免疫組化檢測

將成軟骨誘導15 天的HAMSCs 膜片用4%多聚甲醛固定后，進行HE、甲苯胺藍、番紅以及Ⅱ型膠原免疫組化檢測，觀察細胞形態(tài)和細胞分布、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05.

2 結(jié)果

2.1 HAMSCs形態(tài)學觀察

原代培養(yǎng)的HAMSCs呈長梭形、橢圓形或多角形，貼壁生長。經(jīng)1～2次傳代培養(yǎng)后，可獲得純度較高的人羊膜間充質(zhì)干細胞，第3 代HAMSCs 多呈長梭形，貼壁生長，可見旋渦狀、魚群狀生長的細胞（圖1）。

2.2 HAMSCs鑒定及純度分析

取第3 代HAMSCs 進行流式細胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示：干細胞特性分子CD44、CD73、CD90、CD105 高表達，表達率99%以上，CD34、CD11B、CD19、CD45、HLADR陰性表達（圖2）。

圖1 HAMSCs、HAMSCs膜片、成軟骨誘導HAMSCs膜片大體觀察及細胞形態(tài)學觀察

圖2 流式細胞術(shù)檢測第3代HAMSCs表型分子及純度

2.3 HAMSCs波形蛋白和CK-19的檢測

取第3 代HAMSCs 進行波形蛋白和CK-19 免疫熒光檢測，結(jié)果顯示：HAMSCs 高表達間充質(zhì)干細胞標志物波形蛋白，不表達上皮細胞標志物CK-19（圖3）。

圖3 免疫熒光法檢測第3代HAMSCs波形蛋白、CK-19表達（×100）

2.4 HAMSCs增殖活性檢測

取第3代HAMSCs進行增殖活性檢測，CCK-8檢測結(jié)果顯示：細胞生長呈S 型曲線，傳代培養(yǎng)的HAMSCs第1 天增殖速度較慢，增殖能力較弱。隨著時間的增加，增殖活性不斷增強，接種后第3 天可達對數(shù)生長期，第7天即可以達到平臺期，之后增殖速率保持較穩(wěn)定（圖4）。

圖4 第3代人羊膜間充質(zhì)干細胞增殖曲線

2.5 HAMSCs膜片細胞形態(tài)學觀察、SEM檢測以及流式細胞術(shù)檢測

HAMSCs成膜片誘導15天后，6孔板底部可見一層厚薄較為均勻的白色細胞膜片，倒置相差顯微鏡下觀察見長梭形細胞緊密排列，分布均勻（圖1B1、B2、B3）。SEM觀察顯示膜片呈復層結(jié)構(gòu)，長梭形細胞縱橫交錯，細胞鑲嵌于自身分泌的細胞外基質(zhì)中，胞外基質(zhì)相互融合（圖5）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果示：HAMSCs成膜片誘導15 天后干細胞分子CD44、CD73、CD90、CD105 仍高表達，CD34、CD11B、CD19、CD45、HLA-DR表達陰性（圖6）。

圖5 HAMSCs膜片掃描電鏡檢測

圖6 流式細胞術(shù)檢測HAMSCs膜片細胞表型分子的表達

2.6 成軟骨誘導HAMSCs 膜片細胞形態(tài)學觀察以及成軟骨相關(guān)分子表達水平檢測

HAMSCs膜片成軟骨誘導15天，6孔板底部可見白色膜狀物質(zhì)形成，倒置相差顯微鏡下觀察可見類圓形或橢圓形細胞緊密排列、分布均勻，呈“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)（圖1C3）。RT-PCR 結(jié)果示：與HAMSCs 膜片組相比，成軟骨誘導的膜片組Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、SOX9 表達量顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖7）。

2.7 成軟骨誘導HAMSCs 膜片HE、甲苯胺藍、番紅、免疫組化檢測

HAMSCs膜片成軟骨誘導14天后，HE染色可見大量的類圓形細胞緊密排列；甲苯胺藍染色可見細胞外基質(zhì)呈均勻藍色，細胞成鋪路石樣；番紅染色可見細胞外基質(zhì)呈均勻紅色，表明細胞外基質(zhì)中有大量的蛋白聚糖分泌；II 型膠原免疫組化結(jié)果顯示細胞外基質(zhì)呈均勻的棕黃色，表明胞外有大量II型膠原分泌（圖8）。

圖7 HAMSCs膜片誘導后成軟骨相關(guān)基因mRNA的表達

圖8 成軟骨誘導HAMSCs膜片HE、甲苯胺藍、番紅、免疫組化檢測

3 討論

本研究通過酶消化法獲得了純度高、活力好的HAMSCs，CCK-8 檢測結(jié)果顯示：HAMSCs 在培養(yǎng)6～7天后增殖速度達到高峰，以后保持較為穩(wěn)定的增殖速度，增殖活力強。流式細胞術(shù)檢測示：HAMSCs 高表達干細胞表面分子CD44、CD73、CD90、CD105，不表達CD34、CD11B、CD19、CD45、HLA-DR。免疫熒光檢測示：HAMSCs 高表達間充質(zhì)干細胞表面分子波形蛋白，不表達上皮細胞表面分子CK-19。CD44 為軟骨細胞外基質(zhì)成分透明質(zhì)酸的受體，可以減輕炎癥反應和促進膠原的合成[11]，本研究流式細胞術(shù)結(jié)果顯示HAMSCs CD44 陽性率為99.99%。Parolini 等[12]報道了HAMSCs 低表達主要組織相容性I 類抗原（HLA-A、HLA-B、HLA-C），同時也低表達共刺激分子（CD80、CD83、CD86 等）。本研究也證明HAMSCs 低表達免疫因子CD11B、CD19 及主要組織相容性II 類抗原HLADR，說明HAMSCs 具有低免疫原性，在異體移植中可能會具有免疫豁免特性。

1993年日本學者Okano 提出了細胞膜片技術(shù)，該技術(shù)利用溫敏型聚合物-聚N異丙基丙烯酰胺（PolyNisopropylacrylamide，PIPAAm）對培養(yǎng)皿進行涂層處理，不需要用胰蛋白酶對細胞進行消化即可獲得完整的細胞膜片，從而用于組織工程的構(gòu)建。該聚合物涂層的培養(yǎng)皿至少需要30 分鐘、20℃的低溫條件才能獲得完整膜片，然而，低溫條件會導致細胞膜片的活性降低[13]。也有文獻報道應用溫敏培養(yǎng)皿制備的細胞膜片可能會影響細胞的聚合、分化[14-15]。近年來有文獻報道了其他制作細胞膜片的方法，并取得了一定的效果，其中主要有電反應系統(tǒng)、磁反應系統(tǒng)、光反應系統(tǒng)、PH 系統(tǒng)。但以上方法均存在一定局限性，電反應系統(tǒng)涂層材料會影響細胞粘附生長[16-17]，磁反應系統(tǒng)只能形成多層膜片的復合結(jié)構(gòu)[18]，光反應系統(tǒng)細胞膜片分離困難[19-20]，PH 系統(tǒng)細胞容易受損，膜片難以分離[21-22]。本實驗通過將HAMSCs接種在6孔板中去構(gòu)建膜片，體外培養(yǎng)15天，可以見到在6孔板底部有白色的膜狀結(jié)構(gòu)，SEM觀察可以見到膜片呈復層結(jié)構(gòu)，細胞縱橫交錯、緊密排列，胞外大量基質(zhì)分泌并融合，細胞鑲嵌于基質(zhì)中。該膜片的獲取不需要特殊的材料，保留了細胞分泌的天然細胞外基質(zhì)，保留了外基質(zhì)中的轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、WNT 相關(guān)因子、成纖維細胞生長因子（FGF）、骨形成蛋白（BMP）等細胞因子。有研究顯示：FGF 信號通路[23]、TGF-β和BMP 信號通路[24-25]、WNT 信號通路[26]的激活會促進軟骨損傷的修復和細胞外基質(zhì)的合成。Ye等[27]報道了間充質(zhì)干細胞高密度接種培養(yǎng)時會導致細胞的干細胞特性降低以及加速細胞老化。本研究在誘導HAMSCs成膜片時加入了濃度為50 μg/ml 的抗壞血酸誘導細胞外基質(zhì)大量產(chǎn)生，為細胞的大量增殖提供了充足的生長空間；在HAMSCs 成膜片誘導15天后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示干細胞特性分子CD44、CD73、CD90、CD105仍高表達。

目前，細胞膜片技術(shù)廣泛用于組織工程的研究，其中應用細胞膜片技術(shù)修復角膜、食道的缺損已進入臨床研究階段。2011年，日本已經(jīng)批準應用細胞膜片技術(shù)修復關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨床研究[28]。本實驗成功構(gòu)建了HAMSCs 膜片，但是獲取的HAMSCs 膜片是否具有成軟骨細胞分化的潛能，對于組織工程軟骨的構(gòu)建至關(guān)重要。本實驗利用誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)HAMSCs 膜片，培養(yǎng)15天后，RT-PCR結(jié)果顯示：成軟骨誘導的膜片組高表達成軟骨相關(guān)基因，Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA 的表達量顯著高于HAMSCs 膜片組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。軟骨特異性染色（甲苯胺藍、番紅）及Ⅱ型膠原免疫組化檢測結(jié)果顯示：經(jīng)誘導的HAMSCs 細胞形態(tài)由長梭形變?yōu)轭悎A形，呈“鋪路石”樣緊密排列；軟骨細胞外基質(zhì)特異性染色陽性；Ⅱ型膠原免疫組化結(jié)果顯示細胞外基質(zhì)有大量的II型膠原分泌，表明誘導的膜片具有良好的成軟骨特性。

4 結(jié)論

HAMSCs 具有間充質(zhì)干細胞的表型和特點，具有低免疫原性和多向分化潛能，可以作為軟骨組織工程優(yōu)良的種子細胞。本研究應用一種簡單的方法成功構(gòu)建了HAMSCs 膜片，并且該膜片具有一定的可操作性。體外實驗結(jié)果證實HAMSCs膜片具有良好的成軟骨性能，為HAMSCs 膜片應用于軟骨損傷修復奠定了理論基礎，為今后組織工程軟骨的構(gòu)建提供一種新思路。本研究側(cè)重于觀察HAMSCs膜片成軟骨誘導的體外實驗效果，未來還要在體內(nèi)實驗中觀察HAMSCs 膜片對于軟骨損傷的修復效果。