李海霞 賈然然 邢國(guó)珍 王愛(ài)武 孫金花

摘要：為了解決實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的一些實(shí)際問(wèn)題，本文對(duì)凝膠過(guò)濾分離血紅蛋白與硫酸銅實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)，給出一套簡(jiǎn)單、操作方便、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠且重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)方案，使得該實(shí)驗(yàn)得以在本科教學(xué)中開(kāi)展。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)符合了本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn)，為農(nóng)業(yè)類(lèi)院校生物化學(xué)專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)課提供一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)，同時(shí)降低了實(shí)驗(yàn)成本。本實(shí)驗(yàn)不僅適用于本科生，同時(shí)也適用于研究生進(jìn)行科研素質(zhì)訓(xùn)練，以達(dá)到掌握實(shí)驗(yàn)原理與實(shí)驗(yàn)方法，初步掌握凝膠過(guò)濾分離技術(shù)。

關(guān)鍵詞：凝膠過(guò)慮；實(shí)驗(yàn)教學(xué)；血紅蛋白；硫酸銅

中圖分類(lèi)號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2019）23-0273-02

分離和提純蛋白質(zhì)方法多種多樣，其中最為重要的一種方法就是凝膠過(guò)濾層析。凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法，是一種有效的液相層析色譜技術(shù)，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離迅速及不影響分子的生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于各種生物大分子物質(zhì)的分離和純化[1]。作為一項(xiàng)基本的實(shí)驗(yàn)技能，在農(nóng)業(yè)類(lèi)院校已經(jīng)把凝膠過(guò)濾分離血紅蛋白與硫酸銅作為生物化學(xué)教學(xué)的一項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)[2]。凝膠層析技術(shù)不僅被廣泛應(yīng)用于科研與教學(xué)，同時(shí)也是醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)類(lèi)院校普遍安排的對(duì)本科生和研究生的生化實(shí)驗(yàn)[3，4]。通過(guò)凝膠過(guò)濾分離血紅蛋白與硫酸銅，讓學(xué)生充分了解凝膠過(guò)濾層析的工作原理、方法及應(yīng)用等，初步掌握凝膠過(guò)濾分離技術(shù)。但由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程步驟復(fù)雜、耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，或者實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，再加上儀器、試劑、樣品處理等原因的約束，而使其在本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中很難開(kāi)設(shè)。為了能讓學(xué)生在兩個(gè)學(xué)時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)過(guò)程并且能掌握實(shí)驗(yàn)原理與實(shí)驗(yàn)的方法，我們進(jìn)行了多次的預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)，最后確定了一套實(shí)驗(yàn)方法與步驟，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，充分利用了試劑，對(duì)樣品也進(jìn)行了一些改進(jìn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用直徑為1cm、長(zhǎng)為15cm的層析柱。利用較少的樣品、簡(jiǎn)便的器材即可以完成操作，使其適合在本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開(kāi)設(shè)[5]。現(xiàn)將整個(gè)實(shí)驗(yàn)方案介紹如下。

一、實(shí)驗(yàn)原理

凝膠過(guò)濾的方法廣泛地應(yīng)用于分離、提純、濃縮生物大分子及脫鹽等。凝膠是一種有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶性珠狀顆粒物質(zhì)，用它來(lái)分離物質(zhì)，主要是根據(jù)多孔凝膠對(duì)不同半徑的蛋白質(zhì)分子具有不同的排阻效應(yīng)進(jìn)行分離。把樣品加到充滿(mǎn)凝膠顆粒的層析柱中用緩沖液洗脫，當(dāng)被分離的混合物溶液通過(guò)凝膠的網(wǎng)孔向下運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于大分子物質(zhì)直徑大于凝膠的網(wǎng)孔，不能進(jìn)入膠粒內(nèi)部而完全被排阻在外，沿著膠顆粒間的縫隙向下移動(dòng)，所以大分子物質(zhì)流程短、流速快，首先流出柱外。而一些小分子物質(zhì)由于直徑小于凝膠的網(wǎng)孔，不被排阻，可以自由擴(kuò)散，進(jìn)入凝膠的顆粒內(nèi)部，而后又被經(jīng)過(guò)的洗脫液帶走。由于其不斷地進(jìn)入和流出凝膠顆粒，使其流程變長(zhǎng)、移動(dòng)速度變慢，小分子物質(zhì)反而最后流出層析柱。這樣就使樣品中各組分按相對(duì)分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。凝膠過(guò)濾層析又稱(chēng)之為排阻層析[1]（如Sephadex G-50），是一種按照分子量大小分離物質(zhì)的層析方法[6]。

二、器材和試劑

（一）器材

層析柱、移液管、洗耳球、試管與試管架、分光光度計(jì)、血紅蛋白與硫酸銅、Sephadex G-50等。

（二）試劑

洗脫液：0.05mol/L磷酸緩沖液

血紅蛋白溶液：稱(chēng)取2g血紅蛋白加入10mL蒸餾水中充分溶解。血紅蛋白溶液使用前要進(jìn)行離心，以徹底清除雜質(zhì)，保護(hù)柱床以及保證分離的效果。

堿性硫酸銅溶液：將硫酸銅3.73g溶于10mL熱蒸餾水中，冷卻后稀釋到15mL。另取檸檬酸鈉17.3g及Na2CO3·H2O 10g加水60mL，加熱使之溶解。冷卻，稀釋至85mL。最后把硫酸銅溶液緩緩傾入檸檬酸鈉-碳酸鈉溶液中，混勻即可[6]。

血紅蛋白-堿性硫酸銅混合溶液：在臨使用前將上述血紅蛋白溶液和堿性硫酸銅溶液按體積比1∶1混合待用。

三、操作步驟

凝膠預(yù)處理（提前由實(shí)驗(yàn)員完成）：稱(chēng)取葡萄糖凝膠Sephadex G-50適量（視裝層析柱數(shù)量而定）于燒杯中，加人足量的蒸餾水或洗脫液于沸水浴中溶脹5小時(shí)或室溫溶脹過(guò)夜；待溶脹平衡后，用玻璃棒適度攪拌使之充分懸浮后靜置，等大部分凝膠沉降后，慢慢傾倒去掉漂浮在上層的細(xì)小顆粒；如此反復(fù)傾倒幾次直到清除干凈懸浮的細(xì)小顆粒，然后減壓抽氣去除凝膠孔隙中的空氣，準(zhǔn)備裝柱[6，7]。

1.裝柱。層析柱下端止水，倒入洗脫液，排除氣泡，將底部留少許洗脫液。把溶脹好的凝膠邊攪拌邊倒入柱中，當(dāng)?shù)撞砍练e約2cm凝膠時(shí)，打開(kāi)下端出口開(kāi)關(guān)，讓洗脫液緩緩流出。注意裝柱過(guò)程中層析柱下端需要適時(shí)止水，以保證洗脫液面始終高于凝膠面1cm左右，防止凝膠因脫水而毀柱。待肉眼可見(jiàn)的凝膠沉降至8cm時(shí)為止。

2.清洗與柱平衡。檢查柱床是否均勻，若有氣泡或分層界面，或者殘留物時(shí)，需要重新裝柱或清洗。此時(shí)將裝好的層析柱倒入洗脫液，使洗脫液高于柱床面3—4cm，然后用拇指壓住層析柱管口，水平晃動(dòng)層析柱，使柱內(nèi)葡聚糖完全懸??；然后豎直使其自然沉降后，把多余的洗脫液從底部排出，使層析柱床平衡5分鐘；然后沿著柱壁環(huán)繞加入1—2倍洗脫液清洗平衡層析柱，打開(kāi)下端出口使柱內(nèi)洗脫液不斷流出；最后待液面與凝膠床表面平齊時(shí)（注：整個(gè)清洗平衡過(guò)程中不可使凝膠表面干燥），關(guān)閉出口，停止洗脫。在平衡過(guò)程中調(diào)節(jié)好流速和收集器械，待平衡完成后即可使用。

3.加樣與洗脫。吸取0.2ml樣品距柱床表面1mm處沿管壁輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)加入樣品，然后打開(kāi)底端出口開(kāi)關(guān)，使樣品浸入床表面，用少量的洗脫液同樣小心清洗表面樣品1到2次，使洗脫液流至床表面，以盡量避免樣品的稀釋以保證分離效果；然后用滴管小心加人洗脫液約高于柱床面4cm，調(diào)節(jié)好流速開(kāi)始連續(xù)洗脫收集。在加樣和洗滌過(guò)程中防止沖壞柱床面。

4.收集與測(cè)定。打開(kāi)出口，收集洗脫液，每1.5mL收集一管，共計(jì)5—10管。在451nm波長(zhǎng)處以洗脫液為空白對(duì)照進(jìn)行光吸收測(cè)定，測(cè)定后以收集管數(shù)為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)作曲線(xiàn)圖。

四、結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行裝柱的過(guò)程中要連續(xù)裝柱，才能保證膠柱的均勻。裝柱的過(guò)程中還要一直保持膠體處于洗脫液中，避免干膠。在平衡過(guò)程中要調(diào)節(jié)好流速，以利于收集。流速會(huì)影響分離的效果，太慢了峰值趨緩，太快了可能導(dǎo)致分離不徹底，蛋白峰與鹽峰重疊[7]。流速的調(diào)節(jié)根據(jù)具體情況而定，每分鐘10滴為宜，一管收集18—20滴。

預(yù)先對(duì)層析柱的規(guī)格進(jìn)行了篩選，直徑為1cm、長(zhǎng)為15cm的層析柱是最好選擇。對(duì)加樣量進(jìn)行了優(yōu)化，0.2mL的加樣量剛好能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的要求，達(dá)到比較理想的分離效果。對(duì)于血紅蛋白與硫酸銅實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，Sephadex G-50分離效果最好。為了更精確的測(cè)量光密度值，用5mm規(guī)格的比色皿，增加接收管數(shù)，做出更準(zhǔn)確的曲線(xiàn)圖。

在本科生教學(xué)中開(kāi)展，建議2—3人一組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在20多個(gè)本科專(zhuān)業(yè)開(kāi)設(shè)，實(shí)驗(yàn)學(xué)生人數(shù)達(dá)一萬(wàn)余人次。

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