田文佳 竇桂銘 王莎 孫靖雅 馬玉超

（1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北京 100083）

內(nèi)生鏈霉菌能夠產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物抑制植物病原菌的生長(zhǎng)，也能通過(guò)溶磷、固氮等途徑促進(jìn)植物生長(zhǎng)，這些特點(diǎn)使其在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的生物防治領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景［1]。同時(shí)，鏈霉菌的基因組（5.96-11.94 Mb）較一般細(xì)菌的基因組大，其基因組通常含有十幾到幾十個(gè)次級(jí)代謝基因簇，且單個(gè)基因簇長(zhǎng)達(dá)十幾甚至上百kb。龐大的基因簇及復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程為鏈霉菌抑菌機(jī)制的研究和新的活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)增加了難度，也減緩了其在農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的速度［2]。

全基因組測(cè)序技術(shù)和素有“基因魔剪”之稱的CRISPR/Cas9為鏈霉菌天然產(chǎn)物的深入研究提供了強(qiáng)大的助力［3]。通過(guò)全基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，我們可以了解鏈霉菌次級(jí)代謝基因簇的數(shù)量和類型，預(yù)測(cè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)；通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)基因簇進(jìn)行編輯，可以深入研究基因簇的功能和活性物質(zhì)的生物合成過(guò)程。與傳統(tǒng)的基因編輯方法相比，CRISPR/Cas9具有實(shí)驗(yàn)周期短、編輯片段長(zhǎng)度靈活（既可以是長(zhǎng)片段，也可以是單個(gè)核苷酸）、可以對(duì)基因組進(jìn)行多次編輯等優(yōu)點(diǎn)［4]。因此，該系統(tǒng)現(xiàn)已發(fā)展成為優(yōu)良的基因編輯工具，并迅速成為生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［5]。近年來(lái)，該系統(tǒng)已成功應(yīng)用于Bacillus、Clostridium、Corynebacterium、Escherichia coli、Lactobacillus、Mycobacterium、Pseudomonas、Staphylococcus 和Streptomyces等體系［6-14]。為了利用 CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)鏈霉菌基因組進(jìn)行編輯，Cobb等［15]于2014年構(gòu)建了基因敲除載體pCRISPomyces-2（圖1）。該載體包含以下幾部分元件：sgRNA和密碼子優(yōu)化的cas9基因，lacZ基因側(cè)翼的Bbs I酶切位點(diǎn)，單一的Xba I酶切位點(diǎn)，安普霉素抗性基因［aac（3）-IV]，大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)colE1，RP4接合轉(zhuǎn)移原件oriT和pSG5的溫度敏感rep區(qū)。利用pCRISPomyces-2對(duì)白色鏈霉菌的sshg_05713（67 bp）和sshg_00040/sshg_00050基因（13214 bp）以及綠色產(chǎn)色鏈霉菌的phpD（23 bp）和phpM基因（20 bp）進(jìn)行敲除，效率高達(dá)66%-100%［15]。該系統(tǒng)的構(gòu)建為鏈霉菌多個(gè)復(fù)雜基因簇的功能研究和新結(jié)構(gòu)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了新技術(shù)和新方法，質(zhì)粒的快速構(gòu)建也為敲除基因組上任何目標(biāo)位點(diǎn)提供了方便。

圖1 pCRISPomyces-2的質(zhì)粒圖譜［15]

內(nèi)生鏈霉菌SAT1分離自藥用植物薺苨（Adenophora trachelioides）的根部，對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其與阿南德氏鏈霉菌（Streptomyces anandii JCM 4720T）親緣關(guān)系最近［16]。該菌的菌體和發(fā)酵液對(duì)栗疫菌（C. parasitica）有很強(qiáng)的抑制作用，為了深入研究其抑菌機(jī)制和代謝調(diào)控過(guò)程，實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)Pacbio sequel測(cè)序平臺(tái)對(duì)SAT1進(jìn)行了全基因組測(cè)序。通過(guò)antiSMASH bacterial version（http：//antismash.secondarymetabolites.org/） 分 析SAT1基因組，共預(yù)測(cè)出14種類型37個(gè)次級(jí)代謝基因簇。其中hyBl基因簇與潮霉素B（已報(bào)道對(duì)真菌有抑制活性［17]）基因簇有52%的同源性，可能指導(dǎo)潮霉素B類抗生素的合成，并在抑制栗疫病方面發(fā)揮主要作用。本文通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)建立內(nèi)生鏈霉菌SAT1的基因簇編輯方法，驗(yàn)證hyBl基因簇表達(dá)產(chǎn)物的抑菌功能，同時(shí)也為深入研究其他基因簇功能和代謝調(diào)控途徑提供技術(shù)和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、試劑及引物 本實(shí)驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。安普霉素、氯霉素、卡那霉素和萘啶酮酸均購(gòu)自北京拜爾迪生物科技有限公司；各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker、膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)于大連寶生物有限公司（TaKaRa）；實(shí)驗(yàn)中用到的引物（表2）的合成及測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 實(shí)驗(yàn)中涉及的質(zhì)粒和菌株

表2 實(shí)驗(yàn)中所用引物

1.1.2 培養(yǎng)基 常用的LB、2×YT、PDA、ISP2和TSB培養(yǎng)基配方見(jiàn)文獻(xiàn)［18]。接合用MS培養(yǎng)基：豆餅粉20 g，甘露醇20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 Protospacer的篩選和sgRNA cassettes的合成 作為宿主被CRISPR/Cas9系統(tǒng)識(shí)別切割的標(biāo)記，利用 Strawberry Perl（http：//strawberryperl.com/）從目標(biāo)序列中篩選合適的protospacer（20 bp+NGG，共23 bp序列），特異性序列的篩選依據(jù)以下三個(gè)原則［19]：（1）優(yōu)先選擇 protospacer的 3'端最后四個(gè)堿基為嘌呤的序列；（2）優(yōu)先選擇在非編碼鏈上的序列；（3）保證protospacer的3'端最后12個(gè)堿基和PAM組成的15 bp序列在基因組上的唯一性。根據(jù)以上原則確定最優(yōu)的protospacer序列，并與gRNAtail、T7term、gapdhp（EL）及 Bbs Ⅰ 酶切位點(diǎn)序列共同組裝成sgRNA表達(dá)盒。sgRNA表達(dá)盒序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，并保存于質(zhì)粒pUC57上（載體命名為pUC57-gRNA）。

1.2.2 CRISPR/Cas9 敲除載體的構(gòu)建 載體構(gòu)建過(guò)程如圖2所示。首先用Bbs I分別酶切pUC57-gRNA和pCRISPomyces-2，切膠回收sgRNA cassettes和線性的pCRISPomyces-2，后者進(jìn)行去磷酸化處理，然后采用Golden Gate Program（37℃ 10 min，16℃ 10 min，10個(gè)循環(huán)；50℃ 5 min，65℃ 20 min，4℃保存）將sgRNA cassettes插入pCRISPomyces-2載體。反應(yīng)體系為：去磷酸化的pCRISPomyces-2，6 μL；sgRNA cassettes，10 μL ；10×T4 Ligase Buffer，2 μL ；T4 Ligase，1 μL ；Bbs I，1 μL。以 SAT1 基因組DNA為模板，利用兩對(duì)overlap PCR引物對(duì)（表1，CH647_kl_s和 CH647_kl_r；CH660_kr_s和 CH660_kr_r）分別擴(kuò)增兩段同源臂序列，然后利用引物CH647_kl_s和CH660_kr_r進(jìn)行Touchdown PCR實(shí)現(xiàn)兩段同源臂無(wú)縫連接。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s（每個(gè)循環(huán)下降0.5℃），72℃2 min，30 個(gè)循環(huán) ；94℃ 10 min，47℃ 30 s，72℃ 2 min，10個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。最后通過(guò)酶切、連接，將上下游同源臂插入pCRISPomyces_gRNA載體的Xba I位點(diǎn)。

圖2 敲除載體的構(gòu)建

1.2.3 SAT1與E. coli的屬間接合轉(zhuǎn)化 取5 mL含有敲除質(zhì)粒的細(xì)菌菌液（OD600=0.4-0.6）于10 mL試管中，用等體積不含抗生素的LB培養(yǎng)基洗滌兩次棄上清，加入0.5 mL LB重懸作為供體菌。用2×YT培養(yǎng)基制備SAT1孢子懸液（108個(gè)/mL），50℃熱激10 min后，于三角瓶中震蕩孵育至孢子出芽，作為受體菌［20]。將制備好的0.5 mL供體菌和等體積孢子懸液混合，離心后棄上清用剩余液體重懸，滴加到接合培養(yǎng)基上，30℃共培養(yǎng)14-20 h。用25 μg/mL的安普霉素和萘啶酮酸各1 mL覆蓋接合平板，并將接合菌餅涂布均勻，30℃恒溫培養(yǎng)7 d，平板上出現(xiàn)的單菌落可初步確定為接合子。

1.2.4 突變株的鑒定及抑菌活性分析 在目標(biāo)序列上設(shè)計(jì)3條引物，引物1位于上游同源臂之前，引物2位于下游同源臂之后，引物3位于hyBl基因簇上。以接合子基因組DNA為模板，分別采用引物對(duì)1和2，1和3進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證（表1）。將驗(yàn)證成功的突變株連續(xù)轉(zhuǎn)接3次以檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性。之后，將其接種于不含抗生素的ISP2平板上，37℃恒溫培養(yǎng)3 d以去除質(zhì)粒。以PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的栗疫菌（C. parasitica）為指示菌，通過(guò)平板對(duì)峙檢測(cè)突變菌株的抑菌活性。以野生型Streptomyces sp. SAT1為對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Protospacer序列的篩選、sgRNA cassettes的合成及敲除載體的構(gòu)建

本研究敲除的hyBl基因簇由16個(gè)基因組成（ctg4_647-ctg4_662），長(zhǎng)度約15 kb，為盡可能敲除整個(gè)基因簇，我們以位于基因簇首尾的ctg4_647和ctg4_660兩個(gè)基因?yàn)槟繕?biāo)，篩選兩個(gè)基因序列中所有20 bp的protospacer及3'端的NGG序列（共23 bp），最終確定特異性最高的序列是GACCTCGAAG TCGTGCAGGAAGG（ctg4_647） 和 CACGGCGAGA TCGACCAGGACGG（ctg4_660），分別記為 protosp-acer1和protospacer2， 并 按5'-acgc-protospacer1-gRNAtail-T7term-gapdhp（EL）-protospacer2-gttt-3'的順序合成sgRNA表達(dá)盒，序列如圖3-A所示。其中protospacer1由質(zhì)粒上Bbs I酶切位點(diǎn)之前的gapdhp（EL）驅(qū)動(dòng)，protospacer2由表達(dá)盒內(nèi)部的gapdhp（EL）驅(qū)動(dòng)。gRNAtail相當(dāng)于 sgRNA-tracr，協(xié)助protospacer1發(fā)揮作用，質(zhì)粒上的sgRNA-tracr與protospacer2一起形成另外一條sgRNA。

通過(guò)Golden Gate Program程序?qū)gRNA表達(dá)盒插入載體pCRISPomyces-2中，并轉(zhuǎn)化到E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞。鑒于sgRNA表達(dá)盒（499 bp）和載體（約11 kb）的序列長(zhǎng)度相差懸殊，我們?cè)O(shè)計(jì)了引物Bbs I_s和Bbs I_r進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果（圖3-B）表明pCRISPomyces_gRNA構(gòu)建成功。選擇protospacer1上游和protospacer2下游各1 kb序列作為同源臂，并通過(guò)酶切、連接的方法將無(wú)縫連接的上下游同源臂插入pCRIPomyces_gRNA載體的Xba I位點(diǎn)，利用引物Xba I_s和Xba I_r進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果（圖3-C，line2）表明載體pCRIPomyces2_CB構(gòu)建成功。

圖3 A：sgRNA表達(dá)盒序列；B：sgRNA cassettes插入驗(yàn)證；C：上下游同源臂插入驗(yàn)證

2.2 供體菌株類型、離子和接合時(shí)間對(duì)接合效率的影響

重組載體pCRISPomyces2-CB進(jìn)入SAT1細(xì)胞后，Cas9蛋白會(huì)在protospacer1和2的位置進(jìn)行特異性的DNA切割，然后細(xì)胞通過(guò)同源重組修復(fù)DNA的過(guò)程中丟掉兩個(gè)protospacer中間的DNA（圖4-A），從而實(shí)現(xiàn)基因或基因簇敲除的目的。通過(guò)電轉(zhuǎn)化，我們將重組敲除載體pCRISPomyces2-CB轉(zhuǎn)入接合用大腸桿菌，分別獲得E. coli ET12567（pUZ8002/pCRISPomyces2-CB） 和 E. coli S17-1（pCRISPomyces2-CB）兩種供體菌。利用上述兩株重組菌株與SAT1的孢子進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)以E. coli S17-1（pCRISPomyces2-CB）作為供體菌幾乎沒(méi)有獲得接合子，而以甲基化缺陷型的E. coli ET12567（pUZ8002/pCRISPomyces2-CB）作為供體成功得到了接合子。

一定濃度的Ca2+和Mg2+可以增加接合效率，本研究分別利用含有10 mmol Ca2+和Mg2+的MS培養(yǎng)基作為接合培養(yǎng)基，結(jié)果（圖5）表明，含Mg2+的培養(yǎng)基接合效率略高于含Ca2+的培養(yǎng)基。同時(shí)，接合時(shí)間對(duì)接合效率也有明顯的影響。本實(shí)驗(yàn)條件下，16-18 h接合效果最好（圖5），低于16 h，轉(zhuǎn)移到鏈霉菌中的抗生素耐受基因未充分表達(dá)，容易被殺死；高于18 h，菌絲體生長(zhǎng)旺盛，不易篩選到單菌落。經(jīng)過(guò)以上條件的探索，我們成功獲得一株突變株。如圖4-B所示，利用引物對(duì)1和2可以擴(kuò)增出2.5 kb的產(chǎn)物（line3）；利用引物對(duì)1和3擴(kuò)增不出任何產(chǎn)物（line4），與預(yù)測(cè)突變株的結(jié)果相符，初步確定該菌為hyBl基因簇缺失菌株。測(cè)序結(jié)果也表明約14 kb的片段被成功敲除。將突變株接種到不含抗生素的ISP2平板上，置于37℃培養(yǎng)2-3 d以去除質(zhì)粒。再次接種到含抗生素的培養(yǎng)基上，突變株不再生長(zhǎng)，成功得到去除了質(zhì)粒的突變株，將其命名為 SAT1△hyBl。

2.3 SAT1△hyBl抑菌活性分析

連續(xù)轉(zhuǎn)接3次后，SAT1△hyBl菌株形態(tài)比較穩(wěn)定，且再次提基因組驗(yàn)證的PCR結(jié)果與上述一致，證明突變株能夠穩(wěn)定遺傳。用ISP2固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，突變株的生長(zhǎng)速度明顯慢于野生株，去除質(zhì)粒的SAT1△hyBl生長(zhǎng)速度略慢于野生株（圖6-a、b和c）。抑菌活性分析結(jié)果（圖6-A、B和C）表明無(wú)論抑菌圈的寬度還是面積，突變株SAT1△hyBl對(duì)栗疫菌的抑制活性明顯小于野生型菌株。對(duì)兩者進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)野生型和突變型菌株對(duì)栗疫菌的抑菌圈寬度分別為1.17±0.047 cm和0.27±0.047 cm（表3），突變型菌株相對(duì)于野生型菌株降低了77%。綜上所述，hyBl基因簇在拮抗菌SAT1抑制栗疫菌的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。

圖4 突變株的獲得和驗(yàn)證

圖5 不同時(shí)間和離子的選擇對(duì)接合效率的影響

圖6 野生型和突變型生長(zhǎng)情況和抑菌活性的比較

表3 野生型和突變型抑菌圈寬度比較

3 討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)來(lái)源于細(xì)菌和古細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)。與常規(guī)遺傳操作技術(shù)相比，該系統(tǒng)應(yīng)用于鏈霉菌具有明顯的優(yōu)勢(shì)。一方面它可以任意編輯小到單核苷酸，大到幾十kb的基因片段，也可以避免 Cre/loxP系統(tǒng)［21]、Flp/FRT系統(tǒng)［22]等無(wú)痕敲除方法帶來(lái)的染色體不穩(wěn)定，敲除周期長(zhǎng)等缺陷，還能避免傳統(tǒng)有痕敲除方法中篩選標(biāo)記不能二次利用的缺點(diǎn)。利用pCRISPomyces-2質(zhì)粒完成基因編輯后，可以在37℃培養(yǎng)去除突變株中的質(zhì)粒，進(jìn)而再次利用相同的篩選標(biāo)記進(jìn)行雙基因或多基因敲除。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)既可以用于鏈霉菌中代謝基因簇的功能驗(yàn)證、代謝調(diào)控機(jī)制的探索、干擾鏈霉菌中代謝旁路提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，也可用于對(duì)PKS（聚酮合成酶）或NRPS（非核糖體合成多肽）模塊進(jìn)行局部替換以獲得新的天然產(chǎn)物［23]。

CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)有許多優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在一個(gè)不可避免的問(wèn)題，即對(duì)基因組其他位點(diǎn)非特異性切割造成的脫靶效應(yīng)（Off-target effects）［24-25]。增加該系統(tǒng)識(shí)別位點(diǎn)的特異性、解決其脫靶效應(yīng)是應(yīng)用該技術(shù)的前提。本研究按照Cobb等的方法篩選了protospacer，并設(shè)計(jì)了同源臂以提高其特異性，從而精確地實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的編輯。但是屬間接合轉(zhuǎn)化的效率仍然較低，因此還需進(jìn)一步優(yōu)化SAT1的接合轉(zhuǎn)移條件。目前與SAT1親緣關(guān)系最近的阿南德氏鏈霉菌尚沒(méi)有屬間接合的相關(guān)報(bào)道，本研究也為其接合轉(zhuǎn)化條件提供了參考。

構(gòu)建工程菌株提高抗生素產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)新的抗生素對(duì)抗不斷出現(xiàn)的多耐藥細(xì)菌是當(dāng)前次級(jí)代謝基因簇研究的意義所在。自Cobb等首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于鏈霉菌以來(lái)，利用pCRISPomyces-2敲除載體的研究仍然較少。Qin等［26]通過(guò)該技術(shù)對(duì)Streptomyces formicae中的一個(gè)二型聚酮合酶基因簇（BGC30）進(jìn)行功能驗(yàn)證，并進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因簇中forV基因控制鹵素原子的引進(jìn)這一功能。在本實(shí)驗(yàn)中，突變株SAT1△hyBl對(duì)栗疫菌的抑菌活性發(fā)生了顯著降低，表明hyBl基因簇在抑制栗疫菌過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但我們也發(fā)現(xiàn)突變株的活性并未完全消失，因此推測(cè)可能存在其他的基因簇指導(dǎo)合成抑制真菌的活性物質(zhì)，該推測(cè)可以利用本文建立的方法進(jìn)一步深入研究。另外，hyBl基因簇與吸水鏈霉菌中的潮霉素B基因簇僅有52%的同源性，我們推測(cè)該物質(zhì)可能為潮霉素B的結(jié)構(gòu)類似物，但是具體的化學(xué)結(jié)構(gòu)還需后期進(jìn)行物質(zhì)純化和結(jié)構(gòu)解析。

4 結(jié)論

基于CRISPR/Cas9技術(shù)，本文通過(guò)protospacer的篩選、敲除載體的構(gòu)建、接合轉(zhuǎn)移供體菌、輔助離子的選擇及接合時(shí)間等條件的探索，最終以ET12567（pUZ8002/pCRISPomyces2-CB）為供體菌，以含有Mg2+的MS為接合培養(yǎng)基，接合16-18 h，成功敲除14 kb的hyBl基因簇，建立了SAT1的基因簇編輯方法。突變株對(duì)栗疫菌的抑制帶寬降低了77%，這說(shuō)明該基因簇合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物在抑制栗疫菌方面發(fā)揮重要作用。本研究為阿南德氏鏈霉菌（S. anandii）的基因工程操作和內(nèi)生鏈霉菌SAT1抑菌機(jī)制的研究提供了良好的技術(shù)支撐，也從側(cè)面驗(yàn)證了該系統(tǒng)在鏈霉屬中應(yīng)用的廣泛性。