張圓圓 邵冬南 崔百明

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，石河子 832003）

番茄（Solanum lycopersicum）屬于呼吸躍變型果實，在成熟過程中乙烯產(chǎn)量驟增，果實迅速軟化，影響商業(yè)價值。因此，探索能夠抑制番茄果實過度軟化、延長貨架期、便利儲存運輸、增加銷售品質(zhì)的方法顯得尤為重要［1-3]。Zhang等［4]研究表明果實的軟化主要由于整個成熟過程中果實細(xì)胞壁組分和結(jié)構(gòu)的破壞，但確切機制仍不清楚。Roberts等［5]在植物細(xì)胞壁以及其他細(xì)胞器中均發(fā)現(xiàn)有糖基化的N-糖蛋白存在。并且在果實成熟前期，用衣霉素（蛋白質(zhì)糖基化抑制劑）處理后，番茄紅素和類胡蘿卜素等相關(guān)營養(yǎng)成分的積累、葉綠素降解以及果皮組織產(chǎn)乙烯能力都受到抑制，這表明N-糖蛋白的糖基化在果實成熟過程中起重要作用［6]。游離N-聚糖作為糖基化的前體或N-糖蛋白水解產(chǎn)物，在果實成熟階段果皮組織中含量明顯增加［7]。糖苷水解酶（Glycoside hydrolase）作用于N-糖蛋白的各種糖苷或寡糖，使糖苷鍵水解形成游離N-glycans，而缺乏寡糖部分的蛋白質(zhì)會直接影響果實細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的化學(xué)組分，從而破壞細(xì)胞的完整性，導(dǎo)致果實軟化［8-9]。α-甘露糖苷酶（α-Man）切割糖蛋白中存在的高甘露糖型和植物復(fù)合型N-聚糖的末端α-甘露糖苷鍵，番茄α-Man在果實成熟時誘導(dǎo)表達(dá)，調(diào)節(jié)果實成熟軟化過程。過表達(dá)α-Man導(dǎo)致番茄果實過度軟化，而α-Man表達(dá)受抑制的RNAi植株，果實軟化速率下降，硬度增加，保質(zhì)期延長［10]。

目前，對于降低番茄果實軟化程度的問題，通過RNAi抑制細(xì)胞壁修飾相關(guān)基因是最常用的方法，但果實風(fēng)味嚴(yán)重受損［11-13]。Meli等［10]證明α-Man的RNAi植株果實成熟延緩，但營養(yǎng)成分不發(fā)生改變?；蚪M靶向修飾已成為改造基因組和研究基因功能的一個重要手段［14]。而基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯是使用最廣泛的基因編輯技術(shù)，它由Cas9核酸酶和靶向基因組序列的指導(dǎo)RNA（gRNA）組成，能夠簡單、精準(zhǔn)、高效地編輯單個基因的一個或多個靶位點，甚至多個基因的多個位點［15]。已成功應(yīng)用于多種模式植物和作物［16-18]。

本研究通過CRISPR/Cas9基因組編輯手段，靶向加工番茄N-糖蛋白水解關(guān)鍵酶基因α-Man。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得α-Man突變體植株，從而達(dá)到抑制N-糖蛋白降解、降低加工番茄成熟期果實軟化程度的目的，具有重要的生物學(xué)意義及商業(yè)價值。

1 材料與方法

1.1 材料

加工番茄（Solanum lycopersicum）品種里格爾（87-5）作野生型；由上海生工生物工程股份有限公司合成sgRNA表達(dá)框并完成測序工作。

1.2 方法

1.2.1 植物表達(dá)載體構(gòu)建α-Man敲除靶點引物序列設(shè)計：首先根據(jù)加工番茄α-Man序列（EU244853），利用在線軟件CRISPR-PLANT（https：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html）篩選合適的編輯靶點。然后根據(jù)PAM（NGG）位點切割原則設(shè)計靶序列sg_Man_1S，并給出它的互補序列sg_Man_1A（表 1）。

表1 引物序列列表

載體構(gòu)建：首先以hcas9-S/hcas9-A（表1）為引物擴增hCas9目的片段，并通過NcoⅠ/BstEⅡ克隆到pCAMBIA1302載體上，構(gòu)建p1302-Cas9載體；用XhoⅠ酶切載體pBP-35S和p1302-Cas9，以Kan抗性基因替換載體骨架p1302-Cas9的Hyg抗性基因，構(gòu)建pKAN-Cas9載體；然后將公司合成的sgRNA表達(dá)框（圖1）克隆到pUC19載體上，構(gòu)建pUC-sgRNA載體；Hind Ⅲ/EcoRⅠ雙酶切載體pUC-sgRNA和pKAN-Cas9，構(gòu)建pKAN-sgR-Cas9載體；最后通過引物退火的方式將sg_Man_1S/sg_Man_1A結(jié)合成帶黏性末端的雙鏈DNA片段，并利用Ⅱs型限制酶AarⅠ克隆到pKAN-sgR-Cas9載體上，構(gòu)建植物表達(dá)載體pKAN-sgR-Cas9-Man（圖2）。

圖1 sgRNA表達(dá)框示意圖

測序正確的質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌GV3101，通過菌落PCR篩選陽性克隆，活化單班用于番茄外植體侵染。

圖2 植物表達(dá)載體pKAN-sgR-Cas9-Man結(jié)構(gòu)示意圖

1.2.2 加工番茄遺傳轉(zhuǎn)化 首先用2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒（搖床內(nèi)，120 r/min，10 min）番茄種子，并用無菌水漂洗8-10次，播種于1/2MS（MS鹽2.315 g/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0 g/L，pH5.8）培養(yǎng)基上。28℃暗培養(yǎng)2 d，待種子發(fā)芽后，28℃長日照（光照16 h/黑暗8 h）繼續(xù)培養(yǎng)3-4 d；然后取子葉中段、葉柄和莖段，平鋪在共培養(yǎng)基上（MS鹽4.43 g/L+蔗糖30 g/L+植物凝膠1.5 g/L+IAA 0.1 mg/L+ZT 0.5 mg/L，pH5.8）培養(yǎng)，28℃長日照培養(yǎng)2 d；再用AIM合成培養(yǎng)基（含100 μmol/L乙酰丁香酮）制備侵染液（OD600=0.6-0.8），侵染外植體10-15 min后，將其轉(zhuǎn)入表面鋪有一層薄濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，24℃暗培養(yǎng)2 d；之后將外植體轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基（MS鹽4.43 g/L+蔗糖30 g/L+植物凝膠1.5 g/L+IAA 0.1 mg/L+ZT 0.5 mg/L+Carb 300 mg/L+Kan 50 mg/L，pH5.8），28℃長日照培養(yǎng)。每隔10-15 d將外植體轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)3次。最后將分化再生得到的Kan抗性幼苗小心切下，并轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+IAA 0.1 mg/L+Carb 300 mg/L+Kan 50 mg/L，pH5.8）中誘導(dǎo)生根。當(dāng)番茄幼苗生長至成株（10 cm左右）后，將其頂端生長點或芽尖（包含生長節(jié)點）切下轉(zhuǎn)移至擴繁培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+IAA 0.1 mg/L，pH5.8），待擴繁植株長出新葉，取少量葉片進(jìn)行檢測。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定 取1 g左右番茄葉片，SDS法提取番茄基因組DNA作模版，Colony-R和sg_Man_1A（表1）作引物，另加野生型番茄葉片基因組DNA作陰性對照，pKAN-sgR-Cas9-Man質(zhì)粒（100×）作陽性對照，水作空白對照進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 番茄α-Man突變體檢測 以番茄葉片基因組DNA為底物，特異性檢測酶ScaⅠ進(jìn)行酶切，回收純化酶切產(chǎn)物，以純化產(chǎn)物為模板，DT-Man-F和DT-Man-R（表1）為引物，野生型番茄葉片基因組DNA作陰性對照，PCR擴增加工番茄α-Man部分片段（包含靶序列）。擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠純化，進(jìn)行TA克隆和菌落PCR鑒定，選擇正確的單克隆，提取質(zhì)粒繼續(xù)進(jìn)行酶切檢測，選擇鑒定正確的克隆測序。根據(jù)測序結(jié)果比對分析靶序列的編輯情況。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建

α-Man敲除靶點引物序列設(shè)計：α-甘露糖苷酶（α-Man）是植物體內(nèi)N-聚糖加工的關(guān)鍵酶，參與N-聚糖形成和細(xì)胞壁合成。生物信息學(xué)分析表明番茄α-Man全長為11 001 bp，共含有30個外顯子和29個內(nèi)含子。為獲得α-Man的移碼突變體，在α-Man第1外顯子上，起始密碼子ATG后170 bp處設(shè)計長度為18 bp的靶位點序列：5'-GGTCGATCAGTACTATGTTGG-3'，5'端是堿基G，與中間載體pKAN-sgR-Cas9經(jīng)AarⅠ酶切后形成黏性互補末端，同時提高番茄U6啟動子（SlU6）的轉(zhuǎn)錄效率。靶序列3'端為PAM序列TGG，PAM前5個堿基處設(shè)有ScaⅠ內(nèi)切酶識別位點（圖3），用于檢測α-Man突變體。

圖3 加工番茄α-Man靶序列設(shè)計示意圖

SlU6驅(qū)動sgRNA的表達(dá)載體構(gòu)建：植物表達(dá)載體pKAN-sgR-Cas9-Man以pCAMBIA1302為載體骨架，分別使用NcoⅠ/BstEⅡ位點和HindⅢ/EcoRⅠ位點將Cas9和sgRNA以5'-3'方向插入pCAMBIA1302載體中。并通過AarⅠ將18 bp靶序列融合到gRNA支架的5'末端，由SlU6驅(qū)動sgRNA表達(dá)框，花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子驅(qū)動hCas9表達(dá)框。利用EcoRⅤ酶切鑒定表達(dá)載體，結(jié)果符合預(yù)期設(shè)計（圖4-A），同時對陽性克隆進(jìn)行測序驗證，序列比對結(jié)果表明載體構(gòu)建正確。

圖4 靶向α-Man載體構(gòu)建

2.2 加工番茄轉(zhuǎn)基因陽性植株的獲得

試驗前期，試圖通過瞬時轉(zhuǎn)化的方法實現(xiàn)對加工番茄α-Man的編輯，但結(jié)果顯示靶序列并沒有發(fā)生突變。因此，選擇農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方式來獲得加工番茄轉(zhuǎn)基因植株。圖4-B是質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定結(jié)果，得到預(yù)期大小為374 bp的電泳條帶，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

之后活化菌斑，經(jīng)過加工番茄外植體制備、浸染、共培養(yǎng)和3次繼代培養(yǎng)，約30-40 d得到再生植株，20 d后擴繁成株，同時取樣提取基因組DNA。以Colony-R和sg_Man_1A為引物對上述樣品進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果有14株擴增出374 bp大小的特異性條帶，與陽性對照所得目的條帶大小一致，而陰性對照和空白對照均沒有擴增出條帶，說明檢測到14株轉(zhuǎn)基因陽性植株（圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)基因番茄植株的PCR檢測結(jié)果

2.3 α-Man突變體檢測

將轉(zhuǎn)基因植株每20-30 d擴繁一次，共擴繁3次，待擴繁莖段生長至成株，進(jìn)行酶切和PCR檢測，試驗預(yù)期發(fā)生突變的樣品可以擴增出704 bp的目的條帶，而沒有發(fā)生突變的樣品將和野生型對照一樣沒有特征條帶。檢測結(jié)果顯示有8個樣品擴增出704 bp的目標(biāo)條帶（圖6）。

圖6 PCR擴增基因組DNA酶切產(chǎn)物

后期菌落PCR檢測證明只有4號和7號2個樣品可以擴增出目的條帶，選擇鑒定正確的14個單克隆進(jìn)行測序，結(jié)果（圖7）顯示，在靶位點處有一個克隆發(fā)生52個堿基的缺失突變（克隆4-1，圖7-C），而其余13個克隆均發(fā)生單堿基突變，包括C-T轉(zhuǎn)換（克隆1-9，圖7-A）和A-G轉(zhuǎn)換（克隆4-1，圖 7-B）。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察

通過對轉(zhuǎn)基因試管苗和α-Man突變體植株表型的觀察和記錄，發(fā)現(xiàn)與野生型加工番茄相比，它們的表型均無明顯差異，而且檢測到點突變和缺失突變的植株也沒有明顯的表型差異（圖8）。這與α-Man屬于果實成熟特異性表達(dá)蛋白的研究結(jié)果一致，在番茄生長發(fā)育各階段檢測不到α-Man酶活性，所以植株沒有明顯的性狀。

圖7 α-Man突變體靶位點編輯效應(yīng)測序結(jié)果

圖8 轉(zhuǎn)基因植株表型

3 討論

細(xì)胞壁修飾相關(guān)蛋白α-Man主要參與蛋白質(zhì)糖基化修飾、糖蛋白聚糖水解修飾和復(fù)雜N-聚糖的合成以及果實成熟軟化，被認(rèn)為是破壞細(xì)胞壁的關(guān)鍵因素，α-Man水解 α-1，2、α-1，3和 α-1，6糖苷鍵［10，19]，促使 N-糖蛋白水解產(chǎn)生游離 N-glycans和缺乏寡糖部分的蛋白質(zhì)，從而破壞細(xì)胞壁完整性，導(dǎo)致果實軟化［8]。Meli等［10]研究表明α-Man在番茄果實成熟的破色期和粉紅期階段具有最大活性，而在植物的其他部分（例如莖、葉和根）中均未檢測到α-Man活性。此外，番茄α-Man的RNAi植株果實硬度增加、貨架期延長，并且與細(xì)胞壁降解和成熟相關(guān)基因的表達(dá)均下調(diào)。由此可見，通過抑制α-Man酶活性來降低番茄果實成熟軟化是可行的。本研究利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向修飾加工番茄α-Man，在sgRNA的指導(dǎo)下，Cas9切割一條雙鏈DNA鏈，產(chǎn)生平末端DNA雙鏈斷裂（DSB），再通過非同源末端連接（NHEJ）在DNA斷裂位點處引入堿基置換、插入或缺失等突變［20]。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于多種植物體的瞬時或穩(wěn)定表達(dá)，實例包括使用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)產(chǎn)生的抗白粉病的小麥、耐受性的玉米、不完全成熟的番茄果實以及耐除草劑大豆等［21-24]。

試驗由SlU6驅(qū)動sgRNA表達(dá)框，35S啟動子驅(qū)動hCas9表達(dá)框，構(gòu)建植物表達(dá)載體，在加工番茄中建立CRISPR/CAS9基因編輯體系。U6啟動子是CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)的重要元件之一，不同物種U6啟動子驅(qū)動單個或多個sgRNA已經(jīng)成功應(yīng)用于CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，但適用于番茄的U6啟動子研究鮮有報道［25-27]。目前基于棉花 U6 啟動子的CRISPR/Cas9基因編輯載體系統(tǒng)已在海島棉中實現(xiàn)基因定點編輯［28]，因此，本研究選擇番茄U6啟動子驅(qū)動sgRNA表達(dá)，結(jié)合hCas9蛋白編輯α-Man，成功在轉(zhuǎn)基因加工番茄中檢測到靶序列突變。TA克隆測序結(jié)果顯示有2種編輯類型，一種表現(xiàn)為52 bp的缺失突變，對應(yīng)的氨基酸序列改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯結(jié)果改變；另一種表現(xiàn)為單堿基突變，且突變位點多樣，說明編輯效果不一致，效率較低，編輯類型較少，這與棉花原生質(zhì)體和大豆根尖的基因編輯結(jié)果類似，Chen等［29-30]瞬時轉(zhuǎn)化棉花原生質(zhì)體后檢測突變結(jié)果多為單堿基突變，而遺傳轉(zhuǎn)化檢測結(jié)果顯示除了單堿基突變外，還有多堿基缺失突變。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是因為供以Cas9蛋白切割反應(yīng)的時間較短，或者由于設(shè)計的檢測酶切位點ScaⅠ與PAM距離較遠(yuǎn)（5 bp）導(dǎo)致更多的突變沒有被檢測到，除此之外，也可能是檢測樣本量少所致。

Ito等［22]編輯調(diào)節(jié)番茄果實成熟的MADs盒轉(zhuǎn)錄因子RIN基因，結(jié)果在T0再生植株中Cas9切割位點處檢測到單堿基插入和超過3 bp的缺失突變，并且試驗設(shè)計的3個靶點均發(fā)生編輯，而本研究中并未發(fā)現(xiàn)有堿基插入現(xiàn)象。綜上所述，本研究對加工番茄α-Man的編輯效率低也可能與設(shè)計的sgRNA所含GC含量較低或個數(shù)較少有關(guān)。由于單個gRNA誘導(dǎo)的DSB可能被準(zhǔn)確修復(fù)，導(dǎo)致編輯效率降低，因此，試驗后期選擇金門克?。℅olden gate cloning）這一快速、簡便、全面的模塊化載體構(gòu)建系統(tǒng)［31]，以pDIRECT-23C為載體骨架，構(gòu)建雙靶點敲除載體pDIRECT-Man。載體設(shè)計串聯(lián)了2個gRNA誘導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)行切割，來達(dá)到實現(xiàn)加工番茄α-Man的多重編輯，提高編輯效率的目的。除此之外，對于載體pDIRECT-Man的轉(zhuǎn)基因植株，可以直接通過PCR的方式檢測靶向缺失，使得α-Man突變體的篩選更加容易。目前，本研究部分處于加工番茄遺傳轉(zhuǎn)化階段，后期轉(zhuǎn)基因植株的獲得和α-Man突變體的鑒定還有待進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

成功在加工番茄中建立CRISPR/Cas9基因編輯體系，并實現(xiàn)對糖苷水解酶基因α-Man的編輯。