陳 康，王海星，張燕平，李詩言，王 揚，饒 偉，沈 清,*

（1.浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江省麻醉重點實驗室，溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325000；3.浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，浙江 杭州 310023；4.沃特世科技（上海）有限公司，上海 200126）

南極犬牙魚（Dissostichus eleginoides），亦稱美露鱈、南極鱈魚，屬輻鰭魚綱、鱸形目、南極魚科、南極犬牙魚屬，主要分布在南美、澳洲以及次南極區(qū)群島海域，生存水域深及2 500 m，以少骨和肉質(zhì)白嫩晶瑩剔透而聞名[1-2]。犬牙南極魚屬的經(jīng)濟價值比較高，目前的市場平均價格高于金槍魚，被稱為“白金漁業(yè)”[3]。對南極犬牙魚資源的商業(yè)開發(fā)和利用，國際上自20世紀70年代中期開始至今約40年的歷史[4]。我國受條件限制，還未進行實際的漁業(yè)捕撈生產(chǎn)，國內(nèi)也鮮見其漁業(yè)資源和加工利用方面相關報道。

脂質(zhì)組學通過系統(tǒng)分析細胞、體液、組織等脂質(zhì)及其代謝物，識別關鍵的脂生物標志物，反映生物種間差異或特定條件下脂質(zhì)的整體變化[5]。目前，脂質(zhì)組學的分析方法主要有薄層色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、軟電離質(zhì)譜技術、核磁共振法等[6-10]?；陔妵婌F離子化的“鳥槍法”和正相或親水色譜質(zhì)譜聯(lián)用法是脂質(zhì)組學常用的分析方法[11-12]。然而，目前的脂質(zhì)組學質(zhì)譜方法對樣品前處理要求較高，步驟較為復雜，無法滿足研究人員對快速、高通量、實時檢測的需求。

快速蒸發(fā)離子化質(zhì)譜（rapid evaporative ionization mass spectrometry，REIMS）技術是一種無需制備或液相色譜分離的新型原位電離質(zhì)譜技術，使用iKnife、電熱探頭等手持采樣裝置直接蒸發(fā)樣品表面，產(chǎn)生信息豐富的氣溶膠并通過離子傳輸管路進入質(zhì)譜質(zhì)量分析器，數(shù)秒內(nèi)提供分析物的準確分子質(zhì)量譜[13-14]。以REIMS為基礎的生物組織分析無須任何樣品前處理，通常僅需幾秒鐘的時間即可完成數(shù)據(jù)采集與分析并實現(xiàn)生物組織識別，精確度達到90%～98%[15]。目前，REIMS已經(jīng)成功應用于臨床組織切除、腫瘤診斷、微生物鑒定、食品鑒別等，為脂質(zhì)組學研究提供了一種全新的研究方法和研究思路[16-18]。國內(nèi)已有媒體介紹REIMS的新聞通訊，但鮮見相關技術研究報道。

本實驗基于REIMS技術，使用iKnife電切南極犬牙魚肌肉組織，使其表面脂質(zhì)快速蒸發(fā)并進入質(zhì)譜檢測，獲得脂質(zhì)組學輪廓圖譜并進行結構鑒定和相對定量。由于目前國內(nèi)鮮見REIMS相關研究報道，研究成果可促進REIMS理論與技術發(fā)展，拓寬其在生命科學、食品科學等研究領域的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極犬牙魚組織切片樣品 浙江大洋世家股份有限公司。

甲醇、乙腈、丙二醇（均為色譜純） 美國Merck公司；亮氨酸腦啡肽 美國Sigma公司；實驗用水為經(jīng)Millipore超純水儀制備的超純水。

1.2 儀器與設備

Xevo G2-XS四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（配有iKnife手持采樣裝置） 美國Waters公司；Pump11 elite針泵注射進樣器 美國Harvard公司；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 質(zhì)譜條件

iKnife質(zhì)譜技術兩大突出優(yōu)勢為動態(tài)實時和無需樣品前處理，本實驗的南極犬牙魚樣品0 ℃冰水解凍后即可直接檢測。使用iKnife電刀切割南極犬牙魚組織切片表面，生成含有大量復雜離子混合物的氣溶膠，經(jīng)Venturi泵氮氣驅(qū)動，采用正交方式經(jīng)PTFE管引入質(zhì)譜端口后與Kanthal A1燈絲（1.1 ?，3 V，500 ℃）碰撞，隨后脂質(zhì)離子進入質(zhì)譜儀StepWave裝置并有質(zhì)量分析器檢測分析，實驗裝置如圖1所示。以丙二醇-亮氨酸腦啡肽混合物為輔助溶劑，經(jīng)針泵注射進樣器以0.1 mL/min的流量引入端口，用于清洗雜質(zhì)、提高信號強度、鎖定質(zhì)量校正；質(zhì)譜儀掃描時間為1 s；質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1 200；所有數(shù)據(jù)均以負電離模式收集。

圖1 基于iKnife直接采樣南極犬牙魚獲取脂質(zhì)組學輪廓的REIMS設備裝置圖Fig. 1 Setup of iKnife based REIMS for lipidomic profiling of Patagonian toothfish

1.4 數(shù)據(jù)處理

將質(zhì)譜圖經(jīng)MassLynx進行峰匹配、濾噪、中心化和質(zhì)量校準處理，結果保存為txt格式。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到主要離子峰的m/z和峰面積信息，結合高豐度離子二級質(zhì)譜碎片、Lipid MS Predictor和LipidMap脂質(zhì)分子數(shù)據(jù)庫比對確定或推測脂質(zhì)的結構信息，部分低豐度離子二級質(zhì)譜信號較弱，因此結構未能完全確認。數(shù)據(jù)采集軟件Masslynx 4.1和統(tǒng)計分析軟件LiveID由美國Waters公司提供。

2 結果與分析

2.1 iKnife離子化條件優(yōu)化

南極犬牙魚肌肉組織低脂特性對REIMS檢測結果的影響較大。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，iKnife在電切禽畜類肌肉或內(nèi)臟組織時，離子信號響應較強、信噪比較高；電切魚類組織，尤其是犬牙魚等低脂魚類肌肉組織時，脂質(zhì)離子較難被檢測到，噪音影響顯著。因此，首先對iKnife電切條件進行優(yōu)化，調(diào)整輸出功率、切割速率、切割長度，以獲得穩(wěn)定、可靠的南極犬牙魚肌肉組織脂質(zhì)組學輪廓圖譜。

表1 響應面試驗設計方案及結果Table 1 Experimental design and results for RSM

使用響應面法優(yōu)化試驗參數(shù)，以Box-Behnken設計原理，選取磷脂離子母峰m/z 885.55的信噪比作為響應值，輸出功率、切割速率、切割長度為試驗因素，設計優(yōu)化不同試驗條件組合，結果如表1所示。

利用Design Expert 8.0軟件對表1中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析及擬合，得到的信噪比回歸方程為：

Y=46.44+0.19A-0.30B+0.51C+1.87AB-0.6AC+0.47C-2.07A2-2.84B2-3.47C2

由表2方差結果得出模型（P＜0.000 1）極顯著，失擬項（P＝0.160 4）不顯著，R2為0.976 6，該回歸方程與實際數(shù)據(jù)擬合度較高。

根據(jù)圖2所示的3 個因素響應面與等高線圖，最優(yōu)化分析后得出最佳提取條件為輸出功率25.08 W、切割速率0.49 mm/s、切割長度1.03 cm，信噪比預測值為46.465 6。為便于實際操作，將實驗條件調(diào)整為：輸出功率25 W、切割速率0.50 mm/s、切割長度1.0 cm。在最佳條件下進行5 次重復實驗，驗證得到實際信噪比平均值為46.32，此優(yōu)化條件有效。

表2 回歸方程參數(shù)方差分析Table 2 Analysis of variance of regression equation

圖2 m/z 885.55信噪比的響應面及等高線圖Fig. 2 Response surface and contour plots showing the interactive effect of instrumental parameters on the signal-to-noise ratio of m/z 885.55

2.2 脂肪酸離子分析

圖3 m/z 200～400 脂肪酸離子REIMS圖Fig. 3 REIMS spectra of fatty acid ions in the m/z range from 200 to 400

使用iKnife手持采樣的REIMS技術無需任何樣品前處理，通過對組織樣品表面離子化，實時獲得質(zhì)譜輪廓圖，經(jīng)LiveID等軟件識別，并對特征離子峰降維、建模后，可實現(xiàn)未知樣品的實時鑒定與準確度評分。由于前端并未串聯(lián)液相色譜等分離技術，目前REIMS相關研究主要以定性為主。因此，本實驗研究目的主要為獲得低脂魚類南極犬牙魚的脂質(zhì)組學輪廓圖，對各脂質(zhì)分子的絕對含量定量方法未做深入研究。

表3 南極犬牙魚中脂肪酸的相對含量及結構解析Table 3 Relative contents and probable attributions of fatty acids in D. eleginoides

通過對南極犬牙魚肌肉組織進行電切離子化，掃描范圍m/z 100～1 200，同時以亮氨酸腦啡肽（m/z 554.261 5）為內(nèi)標鎖定質(zhì)量并校準質(zhì)量軸。如圖3所示，區(qū)域內(nèi)離子較多，且基質(zhì)噪音也較為明顯；通過對其鑒定和積分，得到結構和相對含量見表3。脂肪酸離子特征表現(xiàn)為，根據(jù)偶氮規(guī)則，其在質(zhì)譜圖中質(zhì)量數(shù)通常為奇數(shù)。實驗共檢出脂肪酸離子17 種，其中信號響應強度最大的為m/z 327.23，相對含量達到了17.81%，經(jīng)鑒定其結構為FA 22∶6，即所熟知的DHA。其次分別為m/z 255.23（FA 16∶0，9.81%）、m/z 281.25（FA 18∶1，9.09%）。m/z 375、389等疑似為超長鏈脂肪酸FA 24∶3 Ep（2.79%）、FA 26∶3（2.96%），其存在可能與南極犬牙魚受極寒環(huán)境脅迫，促使其代謝產(chǎn)生長鏈脂肪酸以提高體液流動性相關[19]；相關假設尚需生物學進一步驗證。

2.3 磷脂離子分析

對質(zhì)譜圖4降噪、去同位素等處理，篩選峰面積大于3.00×105的離子峰，根據(jù)其分子質(zhì)量測定值推算其可能的化學結構，并使用二級質(zhì)譜進行驗證。以m/z 883.53為例，其離子質(zhì)量與磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）離子[PI 38∶5-H]-（C47H80O13P-，883.534 2）最為接近，通過子離子掃描將母離子解離得到，可觀察到由m/z 883.53斷裂的脂肪酸鏈子離子m/z 283.2（FA 18∶0）和m/z 301.1（FA 20∶5），碳原子數(shù)和雙鍵數(shù)與前期推測38∶5吻合，故此可確認m/z 883.53為[PI 38∶5-H]-。通過這種方法可對大多數(shù)磷脂離子結構進行確認，部分低豐度離子因為子離子信號響應不足未做二級質(zhì)譜確認。南極犬牙魚肌肉組織中共鑒定磷脂離子峰10 種，質(zhì)量范圍m/z 736.49～909.55，根據(jù)峰面積采用歸一化法計算相對豐度，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.28%～6.21%。信號最強離子峰m/z 885.55經(jīng)鑒定為[PI 38∶4-H]-，相對豐度達到了19.30%；其次為磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）離子m/z 790.54（[PE 40∶6-H]-），相對豐度為15.24%。通常魚類組織中磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）含量最高，PE次之，PI、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）的含量相對較少[20-21]。然而本實驗中PC和PE分子檢出較少，原因可能是iKnife輸出能量較高，電切過程中通過電能傳輸導致PC丟失膽堿基團，PE丟失氨基基團，最終生成磷脂酸（phosphatidyl acid，PA）離子[PA-H]-[22]。該推論印證了結果中較多[PA-H]-離子的檢出，如m/z 747.50（[PA 40∶6-H]-）、m/z 763.56（[PA O-42∶5-H]-）等。Balog等[23]使用iKnife-REIMS聯(lián)用技術對牛肉、馬肉等動物肌肉組織進行脂質(zhì)輪廓分析，檢出的脂質(zhì)同樣以PE、PA、PI為主。

圖4 m/z 650～1 000磷脂離子REIMS圖Fig. 4 REIMS spectra of phospholipid ions in the m/z range from 650 to 1 000

表4 南極犬牙魚中磷脂的相對含量及結構解析Table 4 Relative contents and probable attributions of phospholipids in D. eleginoides

2.4 方法學驗證

為驗證本實驗基于REIMS的南極犬牙魚脂質(zhì)組學輪廓方法的可靠性，選取主峰脂肪酸離子m/z 281.25、m/z 327.24和磷脂離子m/z 790.54、m/z 885.55為特征脂質(zhì)離子峰對靈敏度、選擇性、精確度等參數(shù)進行方法學驗證[24]。對由于組織樣品無法構建標準逐級稀釋體系，本實驗采用目標脂質(zhì)信噪比為指標研究方法靈敏度。研究結果（表5）顯示，目標脂質(zhì)的信噪比為35.4～95.3，方法靈敏度較高，鑒于南極犬牙魚為低脂魚類，對于脂質(zhì)含量更高的中脂、高脂魚類理論上同樣適用。通過計算目標離子的實際測量值和理論值的偏差確定高分辨質(zhì)譜的選擇性，目標脂質(zhì)離子的偏差為4.17×10－6～9.78×10－6，表明方法分辨率高、選擇性較好，使用相對分子質(zhì)量對脂質(zhì)結構鑒定具有較大的指導意義。方法精密度通過日內(nèi)和日間精密度測量，使用iKnife連續(xù)平行切割南極犬牙魚肌肉組織5 次，并計算目標脂質(zhì)離子峰面積的RSD，得到日內(nèi)精密度；以相同實驗條件連續(xù)平行測試7 d，計算RSD獲得日間精密度。其中日內(nèi)精密度的RSD為3.7%～5.6%，日間精密度的RSD為5.9%～7.3%，本實驗方法精密度好，檢測結果穩(wěn)定。

表5 REIMS南極犬牙魚脂質(zhì)組學輪廓檢測方法驗證Table 5 Validation of REIMS method for lipidomic profiling of D. eleginoides

3 結 論

建立了iKnife和REIMS聯(lián)用技術用于檢測南極犬牙魚的脂質(zhì)組學輪廓。通過響應面優(yōu)化各項參數(shù)后，實現(xiàn)了低脂肌肉組織中脂質(zhì)的離子化，成功檢出17 種脂肪酸離子和10 種磷脂離子。目前該技術尚處于研究探索階段，產(chǎn)生的脂質(zhì)組學輪廓中，根據(jù)各個磷脂分子離子峰的強弱經(jīng)歸一化法處理后反映了不同磷脂分子的相對含量情況，對建立魚類脂質(zhì)的特征指紋譜圖具有重要意義。該方法無需樣品前處理，可實現(xiàn)南極犬牙魚肌肉組織脂質(zhì)組學輪廓的實時檢測，方法選擇性、靈敏度、穩(wěn)定性均較優(yōu)，為脂質(zhì)組學研究提供了新的技術手段。