張露文，姚志軍，王 帥，張振超，王 東，張海珠，劉世國(guó)

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

剛地弓形蟲(chóng)簡(jiǎn)稱弓形蟲(chóng)，是一種呈世界性分布的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，在全世界的血清學(xué)調(diào)查中陽(yáng)性率為10%～70%，其中歐洲一些國(guó)家的陽(yáng)性率可高達(dá)80%[1]。我國(guó)弓形蟲(chóng)的平均感染率為4%～9%[2-3]。宿主免疫力正常者感染弓形蟲(chóng)常無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，處于隱形感染狀態(tài)[4]，但蟲(chóng)體可親嗜宿主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，嚴(yán)重時(shí)對(duì)宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生無(wú)法逆轉(zhuǎn)的影響[5-8]。血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥、抑郁癥和帕金森癥等腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的弓形蟲(chóng)感染率高于正常人群[9]。1958年BUENTELLO等[10]首次提出弓形蟲(chóng)慢性感染可能與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)，且這一學(xué)說(shuō)近年來(lái)得到了許多研究者的支持。STIBBS等[11]研究發(fā)現(xiàn)，慢性弓形蟲(chóng)感染的小鼠腦內(nèi)的多巴胺水平較對(duì)照組小鼠高14%，這可能是弓形蟲(chóng)感染引起嚙齒類動(dòng)物和人行為或運(yùn)動(dòng)異常的神經(jīng)生物化學(xué)機(jī)制。TORREY等[12]研究認(rèn)為，慢性弓形蟲(chóng)感染的精神分裂癥患者有明顯的認(rèn)知功能損傷。國(guó)內(nèi)有學(xué)者認(rèn)為，感染弓形蟲(chóng)的精神分裂癥患者病情重于未感染者[13-14]。

目前，國(guó)內(nèi)研究多集中于外周血IgG 抗體的檢測(cè)，少有弓形蟲(chóng)分子探針檢測(cè)的報(bào)道，基于此，本研究采集同時(shí)期住院的精神疾病和非精神疾病患者外周血標(biāo)本，分別檢測(cè)血清中IgG 抗體和外周血細(xì)胞中弓形蟲(chóng)529分子片段，分別從既往感染、現(xiàn)癥感染和持續(xù)慢性感染及529核酸定性和定量檢測(cè)幾個(gè)方面探討弓形蟲(chóng)感染與精神疾病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料采集2013年5月至2014年12月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的156例精神疾病患者的血液樣本(病例組)和新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院各門診確診非精神疾病患者血液樣品150例(對(duì)照組)。病例組患者均符合《中國(guó)精神疾病分類方案和診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版》中精神病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除了其他感染性疾病。對(duì)照組患者經(jīng)體檢既往無(wú)精神病史，無(wú)腦器質(zhì)性疾病。病例組：男136 例，女20 例；年齡10～63(27.6±9.8)歲；疾病類型：精神分裂癥116例，其他(包括雙相情感障礙、抑郁癥、強(qiáng)迫癥、躁狂癥等)40例；居住地：城市86例，鄉(xiāng)村70例。對(duì)照組：男75例，女75例；年齡5～85(38.9±11.5)歲；居住地：城市69例，鄉(xiāng)村81。參照文獻(xiàn)[16-17]分組方法，將病例組患者分為10～19歲組、20～29歲組、30～39歲組、40～49歲組和>50歲組。

1.2 試劑與儀器弓形蟲(chóng)IgG抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)購(gòu)自珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司；2×Taq MasterMix (Dye)、DM1000 Marker、2×UltraSYBR Mixture (High ROX)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；所用引物序列參考文獻(xiàn)[15]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)Thermo公司，Master cycler 梯度PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Thermo公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，EC3-Darkroom510 Imaging System凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 調(diào)查2組患者均進(jìn)行臨床問(wèn)診，記錄性別、年齡。

1.3.2 弓形蟲(chóng)特異性IgG抗體檢測(cè)2組患者于臨床問(wèn)診后次日8：00抽取空腹肘靜脈血5 mL，室溫靜止1.5～2.0 h,2 500 r·min-1離心 15 min，吸取血清于新的無(wú)菌離心管中，置于 -20 ℃ 下貯存。使用弓形蟲(chóng)IgG抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)檢測(cè)2組患者血清中IgG抗體含量，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀讀取樣本在450 nm和630 nm處的吸光度(A)值，以A450-A610計(jì)算ΔA值。判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性對(duì)照ΔA平均值≥0.50，陰性對(duì)照ΔA平均值≤0.10，臨界對(duì)照ΔA平均值介于0.12～0.35，證明實(shí)驗(yàn)有效。以樣品ΔA值≥臨界對(duì)照ΔA平均值為IgG抗體陽(yáng)性，樣品ΔA值< 臨界對(duì)照ΔA平均值為IgG抗體陰性。弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性者代表患者既往感染弓形蟲(chóng)。

1.3.3 弓形蟲(chóng)529序列PCR檢測(cè)采用酚試劑法提取病例組和對(duì)照組患者血細(xì)胞DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度及其A值，DNA濃度均不低于 50 mg·L-1，A值為1.6～1.9。DNA放置于-20 ℃下貯存。以血細(xì)胞DNA為模板，以弓形蟲(chóng)RH株滋養(yǎng)體(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)教研室傳代保種)DNA為陽(yáng)性對(duì)照，雙蒸水(distillation-distillation H2O，ddH2O)為空白對(duì)照進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq Master Mix (Dye)12.5 μL，DNA模板2 μL，0.5 μmol·L-1外部上游引物和外部下游引物各2.5 μL，5 μmol·L-1內(nèi)側(cè)上游引物和內(nèi)側(cè)下游引物各2.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性 2 min，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸 50 s，15個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像系統(tǒng)分析電泳結(jié)果。巢式PCR陽(yáng)性者代表患者在樣品采集期現(xiàn)癥感染弓形蟲(chóng)。IgG抗體陽(yáng)性及巢式PCR均陽(yáng)性者代表患者持續(xù)慢性感染弓形蟲(chóng)。

1.3.4 弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體拷貝數(shù)檢測(cè)以弓形蟲(chóng)拷貝數(shù)為2.73×101、2.73×102、2.73×103、2.73×104、2.73×105、2.73×106、2.73×107、2.73×108的弓形蟲(chóng)RH株滋養(yǎng)體DNA模板做陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，將對(duì)照組和病例組患者血細(xì)胞DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)其弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體拷貝數(shù)。反應(yīng)體系為 25 μL：2×UltraSYBR Mixture (High ROX) 12.5 μL，DNA模板2 μL，10 μmol·L-1上游引物、下游引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。使用ddH2O作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲(chóng)特異性IgG抗體檢測(cè)及529序列定性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)照組患者中弓形蟲(chóng)特異性IgG抗體陽(yáng)性3例(2.0%)，巢式PCR陽(yáng)性0例(0.0%)，IgG抗體陽(yáng)性及巢式PCR均陽(yáng)性者3例(2.0%)，總陽(yáng)性例數(shù)6例(4.0%)。病例組患者中弓形蟲(chóng)特異性IgG抗體陽(yáng)性82例(52.6%)，巢式PCR陽(yáng)性16例(10.3%)，IgG抗體陽(yáng)性及巢式PCR均陽(yáng)性者8例(5.1%)，總陽(yáng)性例數(shù)106例(67.9%)。對(duì)照組患者的既往感染率、現(xiàn)癥感染率及持續(xù)慢性感染率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；病例組患者的既往感染率高于現(xiàn)癥感染率和持續(xù)慢性感染率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=64.800、85.510,P<0.01)，現(xiàn)癥感染率與持續(xù)慢性感染率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.500，P>0.05)。病例組患者弓形蟲(chóng)感染總陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=148.040，P<0.01)。

M：Marker；1:陽(yáng)性對(duì)照；2：陰性對(duì)照；3～7：對(duì)照組血細(xì)胞DNA樣品；8～12：病例組血細(xì)胞DNA樣品。

圖1 2組患者血細(xì)胞中弓形蟲(chóng)529重復(fù)序列檢測(cè)凝膠電泳

Fig.1 Gel electrophoresis diagram of 529 repeat sequence ofToxoplasmagondiiin blood cells in the two groups

2.2 弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果病例組和對(duì)照組患者血細(xì)胞中弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體拷貝數(shù)分別為(4.057±1.979)×107、(1.089±0.014)×106copies ·L-1;病例組患者血細(xì)胞中弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體拷貝數(shù)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.580，P<0.01)。

2.3 精神疾病患者既往感染、現(xiàn)癥感染、持續(xù)慢性感染弓形蟲(chóng)可能因素分析結(jié)果見(jiàn)表1。各年齡段精神疾病患者弓形蟲(chóng)既往感染率、持續(xù)慢性感染率及感染總陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.429、0.286、4.875，P>0.05)；40～49歲組患者現(xiàn)癥感染率高于10～19歲、20～29歲、30～39歲及>50歲年齡組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.340、15.012、15.693、16.035，P<0.05)；10～19歲、20～29歲、30～39歲及>50歲年齡組患者現(xiàn)癥感染率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。10～19歲、20～29歲、30～39歲、>50歲組患者既往感染率高于現(xiàn)癥感染、持續(xù)慢性感染率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；現(xiàn)癥感染率與持續(xù)慢性感染率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.680，P>0.05)。40～49歲組患者既往感染率高于持續(xù)慢性感染率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.312，P<0.05)；現(xiàn)癥感染率與既往感染率、持續(xù)慢性感染率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.500、0.500，P>0.05)。

不同性別患者之間的既往感染率、現(xiàn)癥感染率、持續(xù)慢性感染率及感染總陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.030、1.241、1.244、0.045，P>0.05)。男性和女性患者的既往感染率均高于現(xiàn)癥感染率、持續(xù)慢性感染率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=85.193、21.538，P<0.01)；現(xiàn)癥感染率與持續(xù)慢性感染率之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P>0.05)。

精神分裂癥患者和其他精神疾病患者之間的既往感染率、現(xiàn)癥感染率、持續(xù)慢性感染率及感染總陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.600、2.915、2.915、1.236，P>0.05)。精神分裂癥患者和其他精神疾病患者的既往感染率均高于現(xiàn)癥感染率、持續(xù)慢性感染率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=56.250、56.257、48.001、48.000，P<0.01)；現(xiàn)癥感染率與持續(xù)慢性感染率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P>0.05)。

表1 不同年齡、性別和疾病類型精神疾病患者的弓形蟲(chóng)感染情況比較

Tab.1 Comparison ofToxoplasmagondiiinfection among different age,sex and disease type psychiatric patients

因素n既往感染/例(%)現(xiàn)癥感染/例(%) 持續(xù)慢性感染/例(%)總陽(yáng)性/例(%)年齡 10～19歲4226(61.9)2(4.8)ab2(4.8)b30(71.4) 20～29歲5432(59.3)2(3.7)ab0(0.0)b34(62.9) 30～39歲3618(50.0)0(0.0)ab4(11.1)b22(61.1) 40～49歲126(50.0)4(33.3)0(0.0)b10(83.3) >50歲108(80.0)0(0.0)ab2(20.0)b10(100.0)性別 男13679(55.9)8(5.9)b8(5.9)b92(67.6) 女2014(70.0)0(0.0)b0(0.0)b14(70.0)疾病類型 精神分裂癥11660(51.7)8(6.9)b8(6.9)b76(65.5) 其他精神疾病4030(75.0)0(0.0)b0(0.0)b30(75.0)

注：與40～49歲組比較aP<0.05；與既往感染率比較bP<0.05。

3 討論

目前診斷弓形蟲(chóng)感染的方法主要是采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)患者血清樣本中的特異性IgG和IgM抗體是否呈陽(yáng)性，或者采用巢式PCR定性檢測(cè)樣品中特定弓形蟲(chóng)基因序列。本研究檢測(cè)了河南省精神疾病患者與非精神疾病患者弓形蟲(chóng)在既往感染、現(xiàn)癥感染及持續(xù)慢性感染的情況。結(jié)果顯示，精神疾病患者IgG抗體陽(yáng)性率明顯高于非精神疾病患者，與國(guó)內(nèi)外多家報(bào)道一致[18]。精神疾病患者弓形蟲(chóng)感染總陽(yáng)性率是非精神疾病患者的16.975倍，高于國(guó)內(nèi)外其他報(bào)道[19-22]。孫慎俠等[23]通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)94例精神病患者的弓形蟲(chóng)IgG抗體陽(yáng)性率為25.53%，對(duì)照組為10.34%。本研究結(jié)果顯示，不同年齡、性別及精神疾病類型患者的弓形蟲(chóng)感染總陽(yáng)性率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[16-17，25]。同時(shí)，隨著年齡增加，精神疾病患者弓形蟲(chóng)感染總陽(yáng)性率整體呈增高趨勢(shì)。推測(cè)原因?yàn)楣蜗x(chóng)是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，而患者在生活過(guò)程中隨時(shí)間延長(zhǎng)增加了感染弓形蟲(chóng)的概率。不同年齡、性別和精神疾病類型患者的弓形蟲(chóng)既往感染率均高于現(xiàn)癥感染率和持續(xù)慢性感染率。10～19歲、20～29歲、30～39歲和>50歲精神疾病患者中，弓形蟲(chóng)的既往感染率均顯著高于同組內(nèi)現(xiàn)癥感染率及持續(xù)慢性感染率，而現(xiàn)癥感染率與持續(xù)慢性感染率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；40～49歲精神疾病患者中只有既往感染率高于持續(xù)慢性感染率。男性精神疾病患者的弓形蟲(chóng)既往感染率低于女性，現(xiàn)癥感染和長(zhǎng)期慢性感染均高于女性，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是由于女性在承擔(dān)家務(wù)勞動(dòng)過(guò)程中，增加了接觸生肉的機(jī)會(huì)，因此增加了機(jī)會(huì)性感染弓形蟲(chóng)的概率。弓形蟲(chóng)在精神分裂癥患者中的既往感染率高于現(xiàn)癥感染率，提示了精神分裂癥患者弓形蟲(chóng)感染多為慢性期，與精神分裂癥的慢性病程一致。有研究顯示，弓形蟲(chóng)感染在精神分裂癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要病因作用[9]。也有研究發(fā)現(xiàn)，治療精神分裂癥及其他精神疾病的藥物對(duì)弓形蟲(chóng)的增殖有明顯抑制作用，如氟哌啶醇和丙戊酸[26]。

弓形蟲(chóng)幾乎可以在所有有核細(xì)胞內(nèi)寄生，全世界成年人中至少有1/3的人感染弓形蟲(chóng)[27]，歐洲一些發(fā)達(dá)國(guó)家感染率高達(dá)80%,我國(guó)血清學(xué)調(diào)查顯示弓形蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率為5%～20%[28]。有研究證明，弓形蟲(chóng)具有嗜神經(jīng)細(xì)胞的特點(diǎn)，可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是在大腦中的弓形蟲(chóng)從速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)換時(shí)會(huì)引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)，從而對(duì)宿主大腦造成不可逆性損傷，因此，弓形蟲(chóng)感染可能是精神疾病的重要誘因之一[29]。GARRUTHERS等[29]研究指出，寄生蟲(chóng)和宿主之間特殊的結(jié)合能夠影響精神障礙和大腦生理功能。但是將弓形蟲(chóng)感染作為精神疾病患者的確切病因仍存在一定的問(wèn)題，如有些地區(qū)的弓形蟲(chóng)感染率很高，但是精神疾病患者人數(shù)卻并不多；同時(shí)，并不是所有的精神疾病患者均可檢測(cè)出弓形蟲(chóng)抗體。免疫力正常的患者感染弓形蟲(chóng)后一般不表現(xiàn)出特異性臨床癥狀，因此，弓形蟲(chóng)感染未得到相關(guān)衛(wèi)生工作者的足夠重視。但近些年越來(lái)越多的研究證明了感染弓形蟲(chóng)對(duì)機(jī)體的危害，因此，相關(guān)臨床醫(yī)生應(yīng)重視對(duì)精神疾病患者的弓形蟲(chóng)檢測(cè)，防止弓形蟲(chóng)感染給患者帶來(lái)的嚴(yán)重后果。同時(shí)應(yīng)注意對(duì)已經(jīng)感染弓形蟲(chóng)的人群進(jìn)行精神疾病的預(yù)防和自查。