蘇 杰，劉 巖，邵宏超

(華北理工大學附屬醫(yī)院眼科，河北 唐山 063000)

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)是嬰幼兒最常見的眼內惡性腫瘤，隨著生活水平及診療技術的提高，RB的治療也由以往的眼球摘除向盡可能保留眼球、提高生存率等方面轉變。microRNA-483(miR-483)與腫瘤的發(fā)生關系密切，在腫瘤細胞增殖、分化、凋亡等過程中起到調控作用，但miR-483在RB中的作用尚不明確。本研究通過對RB Y79細胞株轉染miR-483模擬物及抑制物，探討miR-483在RB細胞中的表達及作用機制，為RB的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器RB Y79細胞株、正常視網膜細胞ARPE-19(深圳豪地華拓生物有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)，細胞自噬染色檢測試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)，RNA提取試劑盒(美國Sigma公司)，SYBR Green實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒(美國Thermo公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)，低速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)，培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)ARPE-19細胞和Y79細胞。Y79細胞懸浮生長，當細胞密度達到80%時，對細胞進行傳代培養(yǎng)；取生長狀態(tài)良好的細胞，以每孔5×105接種于6孔板，于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.2 細胞轉染取處于對數生長期、生長狀態(tài)良好的Y79細胞，轉染前2 h，換成無血清1640培養(yǎng)基，根據細胞轉染的不同，分為miR-483 inhibitors組、miR-483 minics組和陰性對照組。miR-483 inhibitors組和miR-483 minics組細胞分別轉染miR-483 inhibitors和miR-483 minics；細胞轉染后于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6 h后吸出混合液換入正常培養(yǎng)基；于37 ℃、含體積分數5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。采用聚合酶鏈反應檢測各組細胞的轉染情況，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測細胞中miR-483的表達取對數生長期ARPE-19細胞和Y79細胞，按試劑盒要求提取RNA，取10 μL總RNA，配制反應體系進行反轉錄，反應條件：42 ℃ 30 min；85 ℃ 10 min。再次配制反應體系，將已點好樣的8連管板置于RT-PCR儀上進行反應，95 ℃ 3 min預變性；95 ℃ 12 s，62 ℃退火延伸40 s，共40個循環(huán)。

1.2.4 雙染法流式細胞術檢測各組細胞凋亡率取轉染后的Y79細胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，終止消化后收集細胞，1 500 r·min-1離心 5 min，棄上清液，收集細胞；預冷磷酸緩沖液重懸細胞2次，1 500 r·min-1離心5 min，洗滌細胞；按膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(fluorescein isothiocyanate/ propidium lodide，Annexin-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒操作說明書進行實驗；加500 μL Binding Buffer懸浮細胞；加5 μL Annexin V-FITC混勻后，避光室溫孵育15 min加入5 μL PI染色，輕搖混勻，避光條件下室溫孵育10 min；流式細胞儀上機檢測細胞凋亡情況，CELL Quest軟件分析。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞周期取轉染后的Y79細胞，用2.5 g·L-1不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化細胞，終止消化后收集細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，PBS重懸潤洗2次；100 μL PBS重懸細胞，緩慢加入700 μL預冷的體積分數80%乙醇；4 ℃固定過夜；1 000 r·min-1離心 5 min，預冷PBS潤洗2次；加入100 μL RNase(50 mg·L-1)，37 ℃水浴30 min；加入50 mg·L-1PI 400 μL，4 ℃避光染色30 min；流式細胞儀上機檢測各組細胞周期。

2 結果

2.1 miR-483在Y79細胞和ARPE-19細胞中的表達比較miR-483在Y79細胞和ARPE-19細胞中的相對表達量分別為1.83±0.73、1.29±0.32，miR-483在Y79細胞中的相對表達量高于ARPE-19細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 Y79細胞轉染情況miR-483 inhibitors組、miR-483 minics組和陰性對照組Y79細胞中miR-483表達量分別為1.76±0.43、12.32±2.57、4.03±0.98，miR-483 inhibitors組Y79細胞中miR-483表達量低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-483 minics組Y79細胞中miR-483表達量高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.3 Y79細胞轉染后各組細胞凋亡率比較結果見圖1。miR-483 inhibitors組、miR-483 minics組和陰性對照組Y79細胞凋亡率分別為(31.52±0.82)%、(23.34±0.35)%、(26.47±1.09)%，miR-483 inhibitors組Y79細胞凋亡率高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-483 minics組Y79細胞凋亡率低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A:miR-483 inhibitors組；B：miR-483 mimics 組；C:陰性對照組。

圖1 各組Y79細胞凋亡情況

Fig.1 Apoptosis of Y79 cells in each group

2.4 Y79細胞轉染后各組細胞周期比較結果見圖2。miR-483 inhibitors組、miR-483 minics組、陰性對照組Y79細胞G1期所占比例分別為(5.53±0.72)%、(58.88±1.21)%、(43.66±0.84)%；miR-483 inhibitors組Y79細胞G1期所占比例高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-483 minics組Y79細胞G1期所占比例低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A:miR-483 mimics 組；B：miR-483 inhibitors組；C：陰性對照組。

圖2 各組Y79細胞轉染后細胞周期

Fig.2 Cell cycle of RB cell line Y79 after transfected in each group

3 討論

RB是一種致盲率、致死率很高的原發(fā)于視網膜的惡性腫瘤，發(fā)病率為121 000～118 000[1]。放射治療和化學治療是最常用的RB保守治療方法，但放射治療可能會造成嚴重的并發(fā)癥，化學治療又可能誘導腫瘤耐藥而導致治療失敗[2]，因此，尋找一種安全可靠的治療方法尤為重要。

MiR是一種微小核糖核酸，作為癌基因或抑癌基因在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究顯示，miR-483與多種腫瘤的發(fā)生密切相關，其在肝癌[3]、腎上腺皮質癌[4]、結直腸癌[5]、胰腺癌[6]、胃癌[7]等腫瘤中表達升高，且發(fā)揮促癌作用。本研究通過RT-PCR法檢測RB細胞Y79與正常視網膜細胞ARPE-19中miR-483的表達量，結果顯示，Y79細胞中miR-483的表達量明顯升高，提示miR-483可能對RB的生長起到促進作用。

ZHOU等[8]研究發(fā)現，下調miR-483-3p可抑制食管癌細胞的增殖、遷移，促進化學治療藥物誘導的細胞凋亡。ZHENG等[9]研究顯示，上調miR-483-5p可促進鼻咽癌細胞增殖，抑制其凋亡。但目前尚無miR-483與RB關系的報道，本研究通過miR-483 minics瞬時轉染Y79細胞后，流式細胞術檢測細胞凋亡率及細胞周期，結果發(fā)現，轉染miR-483 minics后，Y79細胞凋亡率降低，G1期所占比例增高，細胞周期G1期延長，抑制細胞凋亡；但轉染miR-483 inhibitors后，細胞凋亡率升高，G1期所占比例下降，細胞周期G1期縮短，加速腫瘤細胞凋亡。提示下調miR-483可以抑制RB細胞增殖，阻滯細胞周期中G1/S期過渡，增加細胞凋亡，抑制RB生長。

綜上所述，miR-483在RB細胞中高表達，下調miR-483可以抑制RB細胞生長?；蛑委熆赡艹蔀槲磥砟[瘤治療的新方法，miR-483作為新的基因靶點，可能會在以后RB的臨床治療中發(fā)揮重要作用。