楊翠翠 包訓(xùn)杰 張 麗 李雅莉 李 林 張 蘭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部 北京市神經(jīng)藥物工程技術(shù)研究中心 北京腦重大疾病研究院 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種最常見的癡呆類型和精神障礙。AD的主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能減退、精神行為癥狀和日常社會(huì)生活功能減退這3個(gè)方面，其主要病理特征為老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、突觸和神經(jīng)元大量丟失。全世界有2億4 000萬人患有AD，且每年新增4 600萬新病例，幾乎每7 秒鐘就有一人患上AD[1]。我國是世界上老年人口基數(shù)最大的國家，也是AD患者基數(shù)最多的國家[2-3]。據(jù)估計(jì)，我國已有6～7 百萬AD患者，且在65 歲及以上老齡人口中每年以5%～7%的速度在增長(zhǎng)[4]。AD致殘率高，患者晚期完全喪失獨(dú)立生活能力，隨著我國社會(huì)人口的老齡化，AD帶來了嚴(yán)重的家庭負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。

山茱萸(cornus officinalis)是一種傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥，新鮮山茱萸果肉中的主要成分有單糖、多糖、有機(jī)酸、苷類、環(huán)烯醚萜類、皂苷、黃酮、蒽醌、甾體、三萜、內(nèi)酯等[5-6]。本課題組[7-8]經(jīng)過長(zhǎng)期研究，從山茱萸果肉中提取的有效成分山茱萸環(huán)烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside，CIG)，前期研究表明CIG在體外可以抑制tau蛋白的過度磷酸化，保護(hù)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)[7-8]；而在體內(nèi)試驗(yàn)[9-11]中，CIG灌胃給藥能夠改善穹窿海馬傘切斷擬AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，其主要機(jī)制是抗凋亡，保護(hù)突觸，改善微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)再生。

本研究系統(tǒng)探討CIG對(duì)APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶影響及其作用機(jī)制，主要包括對(duì)腦內(nèi)老年斑沉積、Tau蛋白磷酸化水平以及神經(jīng)保護(hù)作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

三轉(zhuǎn)基因小鼠來源于美國Jackson Lab公司，經(jīng)過筆者科室擴(kuò)繁，每只均經(jīng)過基因型鑒定。其中9月齡3×Tg小鼠22只，同月齡野生型對(duì)照小鼠11只，雌雄各半；14月齡3×Tg小鼠15只，同月齡野生型對(duì)照小鼠15只，雌雄各半；18月齡3×Tg小鼠共計(jì)23只，同月齡野生型對(duì)照小鼠14只，雌雄各半，均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物分級(jí)為無特定病原體級(jí)(specific pathogen free，SPF)。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境是開燈/關(guān)燈每天各12 h，恒溫(23±1) ℃，食物和水自由攝取。

1.2 藥物

CIG(批號(hào)：071207)，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室自行研制。山茱萸為市售(產(chǎn)地河南西峽)，經(jīng)水提、醇沉、大孔吸附樹脂層析，提取和分離獲得CIG，純度為70%(其中莫諾苷含量為67%，馬錢苷含量為33%)達(dá)到國家中藥、天然藥物5類新藥的要求。CIG為棕黃色粉末，水溶性好。實(shí)驗(yàn)中采用干粉劑量，溶解于蒸餾水，制成藥液應(yīng)用。

1.3 試劑和儀器

兔抗BDNF抗體(1∶2 000，美國Epitomics公司)；兔抗Tau-Ser404抗體(1∶1 000，美國Invitrogen公司)；兔抗Tau-Thr217抗體(1∶1 000，美國Invitrogen公司)；兔抗Tau-Ser199/202抗體(1∶1 000，美國Invitrogen公司)；兔抗Tau-5抗體(1∶1 000，美國Abcam公司)；小鼠抗β-actin抗體(1∶2 000，美國Santa Cruz公司)；生物素結(jié)合的馬抗小鼠IgG二抗(1∶200，美國Vector公司)；生物素結(jié)合的羊抗兔IgG二抗(1∶200，美國Vector公司)；山羊抗小鼠IgG二抗(1∶2 000，美國Santa Cruz公司)；山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000，美國Santa Cruz公司)；剛果紅染色試劑盒(中國邁新試劑公司)；FastSYBR Mixture熒光染料(北京康維世紀(jì)生物科技公司)；Genecolour核酸染料(北京金博益生物技術(shù)有限公司)；TIANamp Genomic DNA Kit(天根生化科技有限公司)。

Morris水迷宮箱(DMS-2型，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，F(xiàn)luo Chem化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Protein Simple公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國Thrmo公司)；冰凍切片機(jī)(620-E型，英國Shandon公司)；圖像分析系統(tǒng)(Image-pro Plus型，美國)；光學(xué)顯微鏡：(BH-2型，日本Olympus公司)；電泳儀(PowerPac200型，美國BIO-RAD公司)。

1.4 動(dòng)物分組及給藥

16月齡：對(duì)照組：野生型(wild type,WT)小鼠8只，WT+CIG低劑量組(100 mg/kg)9只；模型組：3×Tg小鼠7只；藥物治療組：3×Tg+CIG低劑量組(100 mg/kg)7只，3×Tg+CIG高劑量組(200 mg/kg)7只。每日1次灌胃給予等體積CIG或者蒸餾水，從16月齡持續(xù)至18月齡。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)

取出腦組織后置于冰上將海馬及皮質(zhì)分離后，放入液氮中速凍，于-80 ℃保存。將凍存于-80 ℃冰箱中的小鼠海馬/皮質(zhì)組織取出并稱質(zhì)量，加入裂解液裂解，之后提取蛋白并定量。蛋白經(jīng) SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，與上述一抗、二抗孵育后，在暗室將超級(jí)化學(xué)發(fā)光底物 A 液與 B 液等量混合，立即加到膜上，0.8 mL/膜，滴勻液體，反應(yīng) 2 min，然后用濾紙吸去多余熒光劑，將膜放到化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中曝光 10 s～5 min。將圖片存為 TIFF 格式。選擇曝光度適中，條帶較為清晰的 TIFF 圖片采用 TINA 軟件進(jìn)行分析，計(jì)算出各組對(duì)應(yīng)條帶整合灰度值同 GAPDH 的相對(duì)百分比。

1.6 腦組織切片及病理染色

1.6.1 免疫組織化學(xué)染色

每只動(dòng)物取3個(gè)腦片放入48孔板中用PBST洗，5 min×3次，吸出PBST，加入400 μL 3% H2O2(體積分?jǐn)?shù))處理10 min以清除內(nèi)源性過氧化物酶。PBST洗，5 min×3次；加入用PBST稀釋的10% (體積分?jǐn)?shù))，300～400 μL室溫封閉1 h，傾去血清加入用一抗稀釋液稀釋的一抗，4 ℃孵育24～48 h，PBST洗，5 min×3次；加生物素標(biāo)記的兔或鼠二抗(稀釋度為1∶100)，室溫孵育1 h，PBST洗，5 min×3次；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗(稀釋度為1∶100)，室溫孵育1 h，PBST洗，5 min×3次；DAB顯色：將DAB工作液體A、B混合倒入孔板內(nèi)，將上述處理過的腦片放入染液中顯色，注意邊染色邊在顯微鏡下觀察，避免染色過深，染好的片子用自來水終止顯色，貼在載玻片上自然晾干，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6.2 尼氏染色

從48孔板中撈取腦片，平鋪于載玻片上充分晾干，將載玻片連同腦片一起置于尼氏染液中染色30 min，之后將取出的腦片用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6.3 剛果紅染色

每只動(dòng)物3個(gè)腦片，平鋪于載玻片上充分晾干，低價(jià)1滴(100 μL)飽和剛果紅液體試劑A，染色10 min；滴加1滴(100 μL)分化液試劑B急速約數(shù)秒，鏡下控制；用水沖洗5 min；蘇木精淺染，水洗，返藍(lán)；常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測(cè)

取小鼠海馬/皮質(zhì)組織(<20 mg)勻漿，使用QIAamp DNA mini Kit試劑盒抽提總RNA，提取的RNA在Nano Drop 2000進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。使用Quantscript RT Kit試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，具體反應(yīng)條件如下：10×RT Mix 2 μL；超純dNTPs 2 μL；隨機(jī)隨物 2 μL；反轉(zhuǎn)錄酶1 μL；RNA 4 μL；去RNA酶水9 μL；37 ℃孵育1 h。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈用染料法進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，所用熒光染料為Fast SYBR Mixture，反應(yīng)體系如下：2×Fast SYBR Mixture 25 μL；正向引物/反向引物各1 μL；cDNA 2 μL；去RNA酶水21 μL。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性，95 ℃，20 s；變性，95 ℃，15 s；退火，60 ℃，30 s；延伸，72 ℃，15 s；變性、退火、延伸步驟循環(huán)40次；熔解曲線分析：95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；高分辨熔解曲線(high resolution melt，HRM)：70～95 ℃。記錄所有樣本擴(kuò)增結(jié)果的CT值，并選擇CT值最小的樣本用Easy Dilution進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為：3、9、27、81、243、729，每個(gè)倍數(shù)設(shè)置3組平行管，共計(jì)18個(gè)樣本，再進(jìn)行上述PCR反應(yīng)，得出結(jié)果利用Rotor Gene-Q自帶軟件計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線以及CT值與初始cDNA濃度之間的線性公式，再將之前每個(gè)樣本CT值帶入公式即得出每個(gè)樣本初始cDNA相對(duì)濃度(代表轉(zhuǎn)錄水平)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CIG對(duì)18月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)老年斑的影響

應(yīng)用剛果紅染色方法檢測(cè)3×Tg小鼠海馬CA1區(qū)老年斑沉積(Aβ plaques)情況。圖1結(jié)果顯示對(duì)照組和對(duì)照給予CIG治療組小鼠海馬CA1區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)老年斑，3×Tg模型組小鼠海馬CA1區(qū)可觀察到散在的老年斑分布，而給予CIG不同劑量治療的3×Tg小鼠腦內(nèi)CA1區(qū)老年斑數(shù)目明顯減少(P<0.01)，詳見表1。

GroupDose/(mg·kg-1)NumberofcasesNumberofAβplaques(ofWT)WT-30WT+CIG100100303×Tg-31.00±0.09###3×Tg+CIG10010030.39±0.07???3×Tg+CIG20020030.19±0.02???

F=55.700，P=0.000;###P<0.001vsWT group;***P<0.001vs3×Tg group.WT： wide type group;WT+CIG100：wide type + CIG(100 mg/kg)group;3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group;3×Tg+CIG100：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 100 mg/kg;3×Tg+CIG200：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;CIG:cornel iridoid glycoside.

圖1 CIG對(duì)18月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)老年斑的影響Fig.1 Effect of CIG on Aβ plaques in the hippocampus of APP/PS1/Tau mice congo red (Scale bar=100 μm)

WT： wide type group;WT+CIG100：wide type + CIG(100 mg/kg)group;3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group;3×Tg+CIG100：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 100 mg/kg;3×Tg+CIG200：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;CIG:cornel iridoid glycoside; Arrow mean amyloid plaques.

2.2 CIG對(duì)18月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化水平的影響

18月齡3×Tg小鼠大腦皮質(zhì)和海馬均觀察到Tau蛋白在Thr217位點(diǎn)磷酸化水平與對(duì)照組小鼠相比明顯升高(P<0.001)，給予CIG低、高劑量可以顯著降低3×Tg小鼠腦內(nèi)Tau蛋白在Thr217位點(diǎn)的磷酸化水平(P<0.01)(圖2)。而Tau蛋白在Thr212位點(diǎn)的磷酸化水平和總Tau的表達(dá)在模型組、對(duì)照組以及CIG治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表2、3。

2.3 CIG對(duì)18月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)BDNF的影響

18月齡3×Tg小鼠海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor， BDNF)表達(dá)量相對(duì)照組小鼠有所下降，給予CIG低、高劑量治療后都看到其表達(dá)量又有所上升(圖3A)。qRT-PCR的結(jié)果顯示CIG能夠增加模型小鼠海馬內(nèi)BDNF mRNA的表達(dá)(P<0.001，圖3B)。尼氏染色結(jié)果顯示，3×Tg小鼠海馬尼氏小體數(shù)量減少，給予CIG 2個(gè)月治療后，尼氏體的數(shù)量明顯增加,詳見表4，圖3。

表2 CIG對(duì)18月齡3×Tg小鼠皮質(zhì)內(nèi)Tau蛋白磷酸化的影響Tab.2 Effect of CIG on Tau hyperphosphorylation in cortex of 3×Tg mice

#P<0.05vsWT group;*P<0.05，**P<0.01vs3×Tg group;WT： wide type group;WT+CIG100：wide type + CIG(100 mg/kg)group;3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group;3×Tg+CIG100：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 100 mg/kg;3×Tg+CIG200：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;CIG:cornel iridoid glycoside.

GroupNumberofcaseHippocampusThr217Thr212WT41.00±0.051.00±0.03WT+CIG10041.19±0.041.05±0.023×Tg41.50±0.04###1.03±0.033×Tg+CIG10041.45±0.031.06±0.053×Tg+CIG20041.25±0.04?1.04±0.06F55.140.569P0.0000.691

###P<0.001vsWT group，*P<0.05vs3×Tg group.WT： wide type group;WT+CIG100：wide type + CIG(100 mg/kg)group;3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group;3×Tg+CIG100：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 100 mg/kg;3×Tg+CIG200：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;Thr217：Tau hyperphosphorylation at Thr217 site;Thr212：Tau hyperphosphorylation at Thr212 site;CIG:cornel iridoid glycoside.

3 討論

AD的典型病理改變?yōu)樯窠?jīng)纖維纏結(jié)和老年斑，并伴隨神經(jīng)元丟失，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的減少，這些病理改變均與記憶損傷有關(guān)[12-13]。山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc.)為山茱萸科植物山茱萸干燥成熟果肉。補(bǔ)益肝腎，澀精固脫。用于眩暈耳鳴，腰膝酸痛，陽痿遺精，遺尿尿頻，崩漏帶下，大汗虛脫。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[14-15]顯示，山茱萸主要具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化及抗癌等作用。CIG是本課題組從山茱萸中提取的有效部位。APP/PS1/Tau小鼠是目前最接近家族型AD的動(dòng)物模型，具有AD的主要神經(jīng)病理學(xué)特征，出現(xiàn)大腦神經(jīng)元死亡、突觸丟失等AD的重要病理變化，且該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型認(rèn)知障礙出現(xiàn)、病理發(fā)生較早，具體病理時(shí)程變化見表5，目前已有大量關(guān)于抗AD新藥研究采用此小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[16-20]，因此本實(shí)驗(yàn)采用3×Tg小鼠作為模型小鼠，野生型小鼠作為對(duì)照小鼠，觀察CIG對(duì)其病理變化的影響，并探索藥物可能的作用機(jī)制。

WT： wide type group;3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group；WT+CIG100：wide type + CIG(100 mg/kg)group；CIG100：CIG 100 mg/kg；CIG200：CIG 200 mg/kg；Thr217：Tau hyperphosphorylation at Thr217 site；Thr212：Tau hyperphosphorylation at Thr212 site;CIG:cornel iridoid glycoside.

表4 CIG對(duì)18月齡3×Tg小鼠腦內(nèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子mRNA的作用Tab.4 Effect of CIG on BDNF mRNA in 3×Tg mice

圖3 CIG對(duì)18月齡3×Tg小鼠的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用Fig.3 Neurotrophic effect of CIG on 3×Tg mice

A: immunohistochemical images of BDNF-stained brain sections in CA1 of hippocampus. Scale bar=100 μm;B: images of Nissl staining for CA3 of hippocampus.Scale bar=100 μm.CIG:cornel iridoid glycoside;WT： wide type group；WT+CIG100：wide type + CIG 100 mg/kg group；3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group；3×Tg+CIG100：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 100 mg/kg；3×Tg+CIG200：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;BDNF：brain derived neurotrophic factor.

老年斑是由淀粉樣蛋白Aβ沉積引起的[21]。其在特定腦區(qū)內(nèi)聚集，引發(fā)相應(yīng)的神經(jīng)毒性作用，造成突觸損傷，神經(jīng)元死亡，它是AD多種病理損害產(chǎn)生的發(fā)生器[22]。本實(shí)驗(yàn)顯示CIG能夠減少Aβ沉積。目前發(fā)現(xiàn)只減少Aβ沉積對(duì)Tau蛋白的磷酸化無作用的藥物并不能有效減少記憶損傷[23]。因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)CIG對(duì)模型鼠腦內(nèi)Tau蛋白異常過度磷酸化的影響。研究[24]顯示將AD患者腦內(nèi)純化出的異常過度磷酸化的Tau蛋白在體外能夠進(jìn)一步明顯促進(jìn)小鼠腦內(nèi)Thr212及Thr217位點(diǎn)的磷酸化及其聚集。本實(shí)驗(yàn)顯示18月齡小鼠腦內(nèi)Tau蛋白在Thr212及Thr217位點(diǎn)的磷酸化水平均明顯增加。CIG能夠降低其在Thr217位點(diǎn)的磷酸化水平，表明CIG對(duì)Tau蛋白的翻譯后修飾具有一定去磷酸化的作用。BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用，并能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng)[25-26]。BDNF的濃度也被作為判斷治療藥物對(duì)神經(jīng)功能影響的一個(gè)重要指標(biāo)[27]。正常神經(jīng)元在生理情況下，尼氏小體數(shù)量較多顆粒較大，反映神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)功能較強(qiáng)。當(dāng)神經(jīng)元變性嚴(yán)重時(shí)，尼氏小體變化尤為明顯，可作為神經(jīng)元損傷標(biāo)志[28]。CIG能夠增加擬癡呆小鼠腦內(nèi)BDNF的表達(dá)，并且能夠恢復(fù)尼氏小體的含量，保護(hù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)，表明CIG對(duì)具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)，減少神經(jīng)元損傷，提高神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)功能的作用。

表5 APP/PS1/Tau小鼠腦內(nèi)病理隨時(shí)程發(fā)生的變化Tab.5 Changes in pathology of APP/PS1/Tau mouse brain

Aβ：amyloid β-protein;CA1：CA1 of hippocampal region;PHFs: paired helical filaments;LTP: long-term potention;PPF: paired-pulse facilitation;SP: senile plaques;NFT: neurofibrillary tangles.

Kuznetsov等[23]提出藥物只改善A年單一病理變化，并不能有效治療AD。應(yīng)該尋找多途徑改善AD病理變化的藥物。本課題組[29-30]以往研究發(fā)現(xiàn)，CIG對(duì)穹隆-海馬傘切斷擬AD大鼠模型、慢性腦缺血擬癡呆動(dòng)物模型均具有改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用，其主要機(jī)制為抑制炎性反應(yīng)、減少神經(jīng)元凋亡、增高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量[29]、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和血管新生[30]，但并不清楚CG是否能夠通過改善AD主要的病理變化提高學(xué)習(xí)記憶能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CIG能夠改善呈現(xiàn)AD主要病理變化的APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制與CIG減少Aβ沉積，Tau蛋白異常過度磷酸化，增加BDNF表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用相關(guān)。