王強 龐文哲 李香荷 高燕霞

(河北省藥品檢驗研究院，石家莊 050000)

柔紅霉素(daunorubicin)是蒽環(huán)類抗生素中一種非常重要的抗腫瘤藥物。臨床上主要用以治療急性白血病。最早于1963年由意大利學(xué)者DiMarco等[1]從波賽鏈霉菌(Streptomyces peucetius)分離獲得。國內(nèi)于70年代從河北正定縣土壤中亦獲得同類放線菌并提取出同類物質(zhì)[2]。

柔紅霉素口服無效，只能靜脈注射給藥，因此僅注射劑一種劑型。注射用鹽酸柔紅霉素，為紅色疏松凍干塊狀物或粉末，屬于發(fā)皰性強刺激性化療藥，原研企業(yè)為意大利輝瑞公司(Pfizer Italia S.r.l)。藥用機理[3]為通過拓?fù)渫之悩?gòu)酶插入脫氧核糖核酸(DNA)，破壞其模板功能，干擾DNA和核糖核酸(RNA)的合成，又可以生成自由基，對細(xì)胞具有高度破壞性，對周圍血管有強烈的刺激性。其主要不良反應(yīng)為：骨髓抑制[4]、心臟毒性[5]及胃腸道反應(yīng)[6]等。

中國藥典2015年版二部[7]和美國藥典(USP)40版[8]收載原料及其制劑，歐洲藥典(EP)9.0[9]、英國藥典(BP)2017[10]等主要國外藥典僅收載原料標(biāo)準(zhǔn)。

注射用鹽酸柔紅霉素為國家食品藥品監(jiān)督管理總局的國家藥品計劃抽驗品種。本文在完成法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合探索性研究對檢驗結(jié)果進行進一步分析，進而對國產(chǎn)注射用鹽酸柔紅霉素的質(zhì)量現(xiàn)狀進行評價，并從安全性和有效性角度對企業(yè)生產(chǎn)工藝和現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)提出建議。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT液相色譜儀(日本島津公司)。Mettler TOLEDO型電子天平(Mettler公司)。YB-2型澄明度檢測儀(天大天發(fā))。GWJ-16型微粒分析儀(天大天發(fā))。

1.2 試藥

鹽酸柔紅霉素(daunorubicin hydrochloride)對照品為USP對照品。鹽酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride)對照品、柔紅霉酮(daunorubicinone)對照品均為EP對照品。

試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 樣品

17批次注射用鹽酸柔紅霉素均為2016年國家藥品質(zhì)量評價性抽驗樣品，涉及3家生產(chǎn)企業(yè)，企業(yè)覆蓋率100%、批準(zhǔn)文號覆蓋率100%；抽樣覆蓋了全國9個省、自治區(qū)和直轄市，其中生產(chǎn)企業(yè)抽樣3批、經(jīng)營企業(yè)與流通環(huán)節(jié)抽樣8批、使用單位抽樣6批。抽樣樣品能代表本品種目前的生產(chǎn)和使用狀況，對其進行檢驗和統(tǒng)計分析，結(jié)果應(yīng)能較好地反映目前國產(chǎn)注射用鹽酸柔紅霉素的質(zhì)量現(xiàn)狀。

2 試驗方法

2.1 法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗

按照中國藥典2015年版二部進行檢驗。

2.2 探索性研究

根據(jù)法定檢驗結(jié)果及發(fā)現(xiàn)的問題，圍繞藥品安全性、有效性和質(zhì)量可控性，進一步開展有關(guān)物質(zhì)、溶液的澄清度、甘露醇、包材相容性和穩(wěn)定性等項目的探索性研究。

2.2.1 有關(guān)物質(zhì)

參照現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)測定方法，采用LC-MS定性，結(jié)合雜質(zhì)對照品定位和原料藥破壞試驗，考察樣品的雜質(zhì)譜。

2.2.2 澄明度檢查

針對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中缺少溶液的澄清度檢查項，通過與類似品種“注射用鹽酸表柔比星”標(biāo)準(zhǔn)對比[11]，建立溶液的澄清度檢查方法。

2.2.3 甘露醇含量測定

國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)均采用甘露醇為凍干骨架，擬通過HPLC法對各企業(yè)甘露醇添加量進行測定分析。

2.2.4 包材相容性考察

針對丁基膠塞可能對質(zhì)量產(chǎn)生影響，開展包材相容性考察。樣品分別采用正置和倒置的方式，進行為期60d的加速試驗[溫度(40±2)℃、濕度(75%±5%)]，以10d為一周期，檢測有關(guān)物質(zhì)、不溶性微粒、溶液的澄清度等檢測項目，考察包材對制劑質(zhì)量的影響。

2.2.5 影響因素考察

參照中國藥典2015年版通則9001原料藥與制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則，考察高溫(60℃)、高濕(25℃,92.5%)和光照(4500lx)條件下，分別對放置5d、10d樣品的性狀、酸度、不溶性微粒、有關(guān)物質(zhì)、含量等指標(biāo)變化情況。

3 結(jié)果與結(jié)論

3.1 現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗及存在問題

3.1.1 檢驗總體結(jié)果

依據(jù)中國藥典2015年版二部檢驗，17批次注射用鹽酸柔紅霉素全部合格，合格率100.0%。

對檢驗數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果體現(xiàn)出一定差異，B企業(yè)樣品的最大單個雜質(zhì)的量和雜質(zhì)總量均較高，且離散程度最大，最大單個雜質(zhì)的量為0.5%～0.7%，雜質(zhì)總量為1.6%～1.9%。A、C企業(yè)樣品最大單個雜質(zhì)的量為0.3%～0.4%，雜質(zhì)總量為0.7%～0.9%，見圖1。初步分析認(rèn)為可能與原料質(zhì)量及穩(wěn)定性有關(guān)，制劑的生產(chǎn)工藝及儲存環(huán)境也是影響產(chǎn)品質(zhì)量的風(fēng)險點。

3.1.2 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)存在問題

(1)有關(guān)物質(zhì)缺失對特定雜質(zhì)的控制：現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)只控制了單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量，缺少對特定雜質(zhì)的控制，尤其是降解物雜質(zhì)的控制，使檢驗結(jié)果不能真實反映藥品的內(nèi)在質(zhì)量。

(2)部分檢驗項目缺失：缺少對注射劑較為重要的溶液的澄清度檢查。

3.2 探索性研究

3.2.1 有關(guān)物質(zhì)

雜質(zhì)與藥品的安全性密切相關(guān)，為進一步明確雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)及來源，開展了雜質(zhì)檢查的探索研究，進而對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)質(zhì)控指標(biāo)及限度的合理性予以評價。

圖1 有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果箱式圖Fig.1 Boxplots of the related substances

(1)雜質(zhì)譜的建立：采用中國藥典2015年版二部的有關(guān)物質(zhì)檢查方法建立樣品雜質(zhì)譜。采用LCMS/MS測定并推測雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和歸屬。17批樣品和3家企業(yè)提供的原料共檢出10個雜質(zhì)，其中雜質(zhì)3、4和10含量較高，分別為0.2%～0.6%、0.1%～0.3%和0.3%～0.7%，為主要雜質(zhì)。通過液相色譜、紫外光譜、質(zhì)譜鑒別和雜質(zhì)對照品比對，確認(rèn)雜質(zhì)3為多柔比星(doxorubicin，EP9.0雜質(zhì)D)，雜質(zhì)4為柔紅霉醇(daunorubicinol，EP9.0雜質(zhì)B)，雜質(zhì)10為柔紅霉酮(daunorubicinone，EP9.0雜質(zhì)A)(下文采用EP的雜質(zhì)命名，分別稱雜質(zhì)3、4、10為雜質(zhì)D、B、A)。有關(guān)物質(zhì)典型譜圖見圖2。

(2)主要雜質(zhì)溯源：通過強制降解實驗，分析主要影響因素及雜質(zhì)來源，雜質(zhì)來源見表1。結(jié)果顯示：在強光、酸、堿、氧化和熱條件下雜質(zhì)A均有明顯增加，為主要降解產(chǎn)物；雜質(zhì)D和B在氧化的條件下有所增加，其他條件增加不明顯。另外，在氧化、熱、堿和光條件下，會產(chǎn)生新的雜質(zhì)。提示相關(guān)企業(yè)應(yīng)注重生產(chǎn)工藝的控制，如配液溫度不當(dāng)，pH值控制不當(dāng)，均會導(dǎo)致雜質(zhì)的增加。

圖2 注射用鹽酸柔紅霉素有關(guān)物質(zhì)HPLC圖Fig.2 HPLC Chromatogram of daunorubicin hydrochloride forinjection in related substances

表1 雜質(zhì)來源與歸屬Tab.1 The impurity sources and results

(3)生產(chǎn)工藝對雜質(zhì)的影響：對比各企業(yè)制劑與原料的雜質(zhì)含量，結(jié)果表明，C企業(yè)制劑與原料雜質(zhì)含量無明顯差異。A和B企業(yè)的制劑與原料相比，雜質(zhì)均有較大幅度提升，各雜質(zhì)含量見表2。3家企業(yè)生產(chǎn)工藝流程基本相同，但產(chǎn)品質(zhì)量存在差異，提示A和B企業(yè)可能存在工藝缺陷。同時，各企業(yè)制劑的穩(wěn)定性也存在明顯差異。B企業(yè)制劑的穩(wěn)定性較差，在60d加速試驗中，雜質(zhì)的量增加明顯，最大單個雜質(zhì)的量從0.7%增加為2.1%，雜質(zhì)總量由1.9%增至3.4%。鑒于原料藥的質(zhì)量直接影響制劑的質(zhì)量。提示該企業(yè)原料生產(chǎn)也應(yīng)進一步提高控制水平。

(4)雜質(zhì)控制建議：探索性研究結(jié)果顯示，17批樣品的主要雜質(zhì)均為雜質(zhì)A、B和D。經(jīng)二元相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)A和D均與雜質(zhì)總量呈正相關(guān)(P＜0.01)，雜質(zhì)B與雜質(zhì)總量未顯示出相關(guān)性，提示雜質(zhì)A和D是本品的主要雜質(zhì)，建議在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中增加對這兩個雜質(zhì)的控制。

表2 各企業(yè)制劑及原料雜質(zhì)統(tǒng)計結(jié)果Tab.2 Impurity content of preparations and raw materials

國外藥典中，EP9.0對雜質(zhì)控制較為全面，探索性試驗參照其進行檢驗，結(jié)果表明：17批次樣品中，14批次樣品合格，合格率82.4%，不合格率為17.6%。不合格產(chǎn)品均為B企業(yè)產(chǎn)品，主要為雜質(zhì)A、D及其他單個雜質(zhì)超出限度。

3.2.2 溶液的澄清度

溶液的澄清度是影響注射劑質(zhì)量的重要因素，針對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中缺少溶液的澄清度檢查項，建立了檢查方法。檢查方法采用中國藥典2015年版通則0902第一法(目視法)。參考類似品種“注射用鹽酸表柔比星”，擬定為“按標(biāo)示量，分別加水溶解成含鹽酸柔紅霉素2mg/mL的溶液，溶液應(yīng)澄清”。采用擬定標(biāo)準(zhǔn)測定17批樣品的澄清度，結(jié)果表明，17批次樣品溶液的澄清度全部合格，均不超過0.5號濁度標(biāo)準(zhǔn)液的濁度，合格率100.0%。

3.2.3 甘露醇(賦形劑)含量測定

藥用賦形劑對注射劑的穩(wěn)定性、pH值、滲透性、生物利用度和透明度等指標(biāo)具有重要影響，甚至能影響到藥品的安全性。注射用鹽酸柔紅霉素為鹽酸柔紅霉素加適量甘露醇制成的無菌凍干品，甘露醇占裝量的80%以上。通過HPLC法對各企業(yè)甘露醇添加量進行測定分析。對17批樣品的測定結(jié)果表明，A企業(yè)樣品甘露醇添加量為處方量的100.8%～102.5%，B企業(yè)為101.6%～103.0%，C企業(yè)為100.9%～102.7%?？梢姡髌髽I(yè)均能按照處方準(zhǔn)確添加。

3.2.4 包材相容性

文獻報道，抗生素針劑溶液的澄清度會受膠塞影響[12-13]。針對注射劑采用的膠塞可能對質(zhì)量產(chǎn)生的影響，開展包材相容性考察。數(shù)據(jù)分析可知，樣品與膠塞的接觸對性狀、溶液的澄清度基本無影響，有關(guān)物質(zhì)基本保持不變，并未生成新的雜質(zhì)。對不溶性微粒影響較大，倒置樣品微粒數(shù)明顯高于正置樣品，但仍符合規(guī)定。

3.2.5 影響因素考察

注射用鹽酸柔紅霉素使用范圍較廣，但國內(nèi)生產(chǎn)廠家較少，因此，經(jīng)常涉及到大范圍長途藥物運輸情況。為考察在運輸和儲存過程中環(huán)境變化對制劑質(zhì)量的影響，開展穩(wěn)定性試驗。

在高溫環(huán)境下，性狀、酸度無明顯變化，含量下降約2%～3%，雜質(zhì)數(shù)及雜質(zhì)含量均明顯增加，在第5天，B企業(yè)樣品的最大單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量分別達到2.1%和3.3%，均超過現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)限度。進一步分析得知為柔紅酶酮增加所致，可見溫度對產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量影響明顯。

在光照條件下，外觀、酸度無明顯變化，藥品含量下降不足1%，雜質(zhì)含量略有上升，提示應(yīng)注意避光保存，經(jīng)10d試驗，無不符合規(guī)定批次出現(xiàn)。

在高濕條件下，藥品各項指標(biāo)均無明顯變化，可見產(chǎn)品包裝密封性較好，濕度不會成為影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素。

綜上所述，光照和溫度會對產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)和含量產(chǎn)生不同程度的影響，說明應(yīng)注意控制樣品的儲存條件。

4 討論

本次藥品評價性抽驗結(jié)果顯示，依照現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)檢驗，全部17批樣品均符合規(guī)定，國產(chǎn)注射用鹽酸柔紅霉素總體質(zhì)量狀況“較好”。

通過以上分析集合探索性研究可知，影響本品質(zhì)量的主要因素有原料藥的質(zhì)量，制劑的生產(chǎn)工藝和溫度的控制，提示應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)原料，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，嚴(yán)格控制生產(chǎn)過程及貯存過程中的溫度控制，確保制劑臨床使用的安全性和有效性。次要因素主要是包材質(zhì)量，應(yīng)重視膠塞對不溶性微粒的影響，提示在生產(chǎn)過程中應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)的包材。

此外，現(xiàn)行中國藥典標(biāo)準(zhǔn)有待進一步完善。建議：(1)提高原料和注射劑的有關(guān)物質(zhì)的控制水平，增加對降解雜質(zhì)A和D的控制，并制定相關(guān)限度；(2)增加溶液的澄清度檢查。