劉海英 張秋實(shí) 蘇旭明 張學(xué)新

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院神經(jīng)外科 河北石家莊 050012

膠質(zhì)瘤是人中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，約占顱腦腫瘤的47%。其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是人中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)的高度惡性腫瘤，約占神經(jīng)膠質(zhì)瘤的60%，因其增殖迅速、高浸潤(rùn)性及復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)導(dǎo)致患者預(yù)后很差，中位生存期約14.6 個(gè)月，5年生存率不超過(guò)10%[1]。因此，深入研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找其發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，探究腫瘤相關(guān)分子機(jī)制是治療膠質(zhì)瘤的一項(xiàng)重要手段。研究顯示SHH（Sonic Hedgehog）信號(hào)通路在胚胎發(fā)育尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起到重要作用。不僅如此近年來(lái)研究也證明，SHH 信號(hào)通路在多種腫瘤如髓母細(xì)胞瘤、胃癌、肝癌、基底細(xì)胞癌、肺癌、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2-6]。

Glioma-associated oncogene 1（Gli-1）是一類(lèi)含有鋅指結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，在多種生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7-8]。以往的研究中顯示，Gli-1 是SHH 信號(hào)通路激活中不可缺少的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)程度可直接反應(yīng)Shh 信號(hào)通路的激活狀況[6,9]。而在膠質(zhì)瘤中SHH 信號(hào)通路及Gli-1 的表達(dá)情況目前尚顯有報(bào)道。不僅如此，Gli-1 與代表腫瘤惡性分化能力的Ki-67 蛋白的相關(guān)性研究更是GBM 發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中的一項(xiàng)短板。因此本研究旨在利用RT-PCR 及免疫組化技術(shù)，探究人腦膠質(zhì)瘤中SHH 信號(hào)通路中核轉(zhuǎn)錄因子Gli-1 的表達(dá)情況，探尋膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，為臨床實(shí)踐提供一定的指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集我院神經(jīng)外科自2014年5月至2017年5月資料完整的行開(kāi)顱手術(shù)患者腫瘤標(biāo)本，經(jīng)病理證實(shí)為膠質(zhì)瘤標(biāo)本50 例。其中男性28 例，女性22 例。年齡17-72 歲，中位年齡47 歲；病理學(xué)分級(jí)依據(jù)2016年WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ級(jí)9 例，Ⅱ級(jí)12 例，Ⅲ級(jí)13 例，Ⅳ級(jí)16 例，其中Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)作為低級(jí)別腫瘤組，Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)作為高級(jí)別腫瘤組。選取同期因腦外傷手術(shù)患者非腫瘤腦組織10 例作為對(duì)照組。

1.2 試劑

兔抗人Gli-1 多克隆抗體（ABGENT 公司）、鼠抗人單克隆抗體Ki-67（武漢博士德生物工程有限公司）、SP9001 免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo 公司）。

1.3 RT-PCR

于NCBI 基因庫(kù)查找相應(yīng)的基因mRNA 序列，應(yīng)用 Oligo 5.0設(shè)計(jì)引物，返回NCBI，進(jìn)行Primer-BLAST，采用特異性較好引物序列。引物序列由Invitrogen 公司合成（表1）。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及正常腦組織中Gli-1 及Ki-67 的表達(dá)

將取得的膠質(zhì)瘤標(biāo)本、非腫瘤腦組織經(jīng)甲醛溶液固定后，石蠟包埋切片，梯度復(fù)水后3%過(guò)氧化氫(H2O2)室溫避光孵育30min，PBS 沖洗2 次，EDTA 熱修復(fù)后PBS 沖洗2 次，血清封閉液37℃溫箱封閉1h，吸取多余血清后滴加一抗(Ki67 1:100，Gli-1 1:100)，4℃孵育過(guò)夜。次日PBS 沖洗2 次，加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃溫箱孵育30min，PBS 沖洗2 次，加鏈酶卵白素工作液，37℃溫箱內(nèi)孵育30min，PBS 沖洗2 次，DAB 顯色，復(fù)染。光鏡下觀察結(jié)果并拍照。

Gli-1 免疫組化表達(dá)均主要為細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中，Ki67 免疫組化表達(dá)均主要為細(xì)胞核中。采用Friedrich 等的免疫反應(yīng)評(píng)分（immunoreactivity score，IRS），采用半定量標(biāo)準(zhǔn)：高倍視野下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為0 分；＞10%-50%為1 分；＞50%-75%為2 分；＞75%為3 分。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分?？傮w評(píng)價(jià)：以上述2 項(xiàng)得分相乘：0 分判為“-”，1 分～4 分判為“+”，5 分～7 分判為 “++”，≥8 分判為“+++”。以“++”和“+++”定義為陽(yáng)性，“－”和“+”定義為陰性。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及正常腦組織中Gli-1mRNA 及Ki-67 的表達(dá)

將手術(shù)取下的各腫瘤組織及非腫瘤腦組織半小時(shí)內(nèi)放入無(wú)菌、無(wú)酶凍存管，存至-80℃冰箱。組織標(biāo)本在研缽中碾碎，用TriQuick 總RNA 提取試劑提取組織總R NA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，20μl 反應(yīng)體系進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)[Mix 10μl，上游引物 (5μM)0.4μM，下游引物 (5μM) 0.4μM，cDNA 0.4μg，去離子水至20μl]。反應(yīng)條件：95℃5min，95℃ 30s，56 ℃（Ki-67）/58 ℃（Gli-1）/57℃（GAPDH）30s，72℃ 45s，72℃ 7.5min (35 個(gè)循環(huán))。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別測(cè)定樣本基因及對(duì)應(yīng)內(nèi)參灰度值，以灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法；計(jì)量資料以()表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn), 相關(guān)性分析采取等級(jí)相關(guān)分析。用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析法分析人腦膠質(zhì)瘤組織中Gli-1、Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性，以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

Gli-1、Ki-67 均高表達(dá)于GBM 細(xì)胞中。Gli-1 定位于細(xì)胞胞質(zhì)、胞核（見(jiàn)圖1），Ki-67 定位于細(xì)胞胞核（見(jiàn)圖2）。

圖1：高級(jí)別膠質(zhì)瘤（A）、低級(jí)別膠質(zhì)瘤（B）、非腫瘤腦組織（C）Gli-1 免疫組織化染色 (×400)圖1：Examples of immunohistochemical staining of Gli-1

圖2：高級(jí)別膠質(zhì)瘤（A）、低級(jí)別膠質(zhì)瘤（B）、非腫瘤腦組織（C）Ki-67 免疫組織化學(xué)法染色 (×400)圖2：Examples of immunohistochemical staining of Ki-67

Gli-1 的表達(dá)在高級(jí)別GBM 中為65.52%（19/29），低級(jí)別GBM 中為23.81%（5/21），正常腦組織中為10%（1/10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.192，P＜0.01）。（表1）。高級(jí)別GBM 與正常腦組織陽(yáng)性率對(duì)比、低級(jí)別GBM 與正常腦組織陽(yáng)性率對(duì)比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Ki-67 的表達(dá)在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中為72.41%（21/29），低級(jí)別膠質(zhì)瘤中為14.28%（3/21），正常腦組織中為10%（1/10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.508，P＜0.01）（表2）。

2.2 RT-PCR 結(jié)果

GLi-1 mRNA 在高級(jí)別膠質(zhì)瘤、低級(jí)別膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.145±0.020、0.083±0.070、0.060±0.039，P=0.004，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，高級(jí)別膠質(zhì)瘤與對(duì)照組、低級(jí)別GBM 與對(duì)照組間相對(duì)表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0125）。Ki-67 mRNA 在高級(jí)別膠質(zhì)瘤、低級(jí)別膠質(zhì)瘤和對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.147±0.032、0.113±0.070、0.049±0.035，秩和檢驗(yàn)結(jié)果：χ2=11.30，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(表3)。

2.3 相關(guān)性分析

采用Spearmen 等級(jí)相關(guān)分析法，在各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中Gli-1的表達(dá)與Ki-67 呈正相關(guān)（r=0.68，P＜0.05）。

表1：不同級(jí)別膠質(zhì)瘤和正常腦組織對(duì)照組Gli-1 IHC 染色結(jié)果比較

表2：不同級(jí)別膠質(zhì)瘤和正常腦組織對(duì)照組Ki-67 IHC 染色結(jié)果比較

表3：ki-67、Gli-1 mRNA 在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤及正常腦組織中的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

SHH 信號(hào)通路在普遍存在于正常的人體組織中，對(duì)于胚胎發(fā)育、細(xì)胞成熟、細(xì)胞分化、內(nèi)分泌激素的產(chǎn)生有著不可替代的重要作用。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，學(xué)者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)SHH 信號(hào)通路在腫瘤組織中也有明顯的異常激活現(xiàn)象。

Yuan Z 等研究發(fā)現(xiàn)，SHH 信號(hào)通路在原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中存在廣泛激活的現(xiàn)象，DNA 芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)87%腺癌和93%的鱗癌存在GLi-1 的高表達(dá)。而在小細(xì)胞肺癌（SCLC）中，Gli-1 的表達(dá)顯著降低[10-12]。證實(shí)Shh 信號(hào)通路在NSCLC 中普遍存在，且以鱗癌的臨床意義最為突出。在胰腺癌中，阿布拉等通過(guò)RT-PCR 實(shí)驗(yàn)證明Shh、Ptch-1、Smo、Gli-1 在胰腺癌組織中表達(dá)量明顯高于胰腺癌旁組織及正常胰腺組織，在表型為CD44+CD24+ESA+的胰腺癌干細(xì)胞中, Shh 的表達(dá)量比正常的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞高出46 倍[13-15]。在胃癌中，相關(guān)研究表明Shh 的缺失與幽門(mén)螺桿菌感染及腸上皮化生有關(guān)[5,16-17]。Saze 等對(duì)胃癌組織的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Shh、Ptch-1 的高表達(dá)水平與胃癌的預(yù)后不良有顯著關(guān)系，且Shh 通路中的 Ptch-1 高表達(dá)可能與胃癌的進(jìn)展有關(guān)[18]。

Shh 廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、胃腸、四肢。在神經(jīng)系統(tǒng)形成過(guò)程中，早期成熟分化的神經(jīng)細(xì)胞分泌Shh，作用于遠(yuǎn)處的Gli（+）神經(jīng)前體細(xì)胞，促進(jìn)其增殖分化為終末細(xì)胞。當(dāng)終末細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量后，負(fù)反饋于成熟的神經(jīng)細(xì)胞，Shh 分泌減少，前體細(xì)胞的增生減退，通過(guò)這種自我反饋的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)個(gè)體發(fā)育中腦組織的大小和形狀[19,20]。研究顯示在神經(jīng)信號(hào)系統(tǒng)成熟后，Shh-Gli 信號(hào)通路處于失活狀態(tài)。而異常激活的Shh-Gli 將引起顱內(nèi)相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Jeng 等[21]研究發(fā)現(xiàn)阻斷Shh 信號(hào)通路可限制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散。Ptch-1 的突變與人髓母細(xì)胞瘤的關(guān)系也被廣泛證實(shí)[22]。何青蘭等[23]用RT-PCR 檢測(cè)體外培養(yǎng)的U251 惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及人腦膠質(zhì)瘤組織中Shh 信號(hào)通路因子mRNA 的表達(dá)，結(jié)果顯示在U251 細(xì)胞和膠質(zhì)瘤組織 中的Shh mRNA的表達(dá)分別高于其在瘤周組織的表達(dá)，提示Shh 的信號(hào)通路異常參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Shahi 等[24]研究發(fā)現(xiàn)Gli-1、Gli-3 mRNA 在大部分星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤組織中呈明顯的高表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)以Shh 信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子Gli-1 作為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫組化的實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)10 例正常腦組織中Shh、Gli-1 不表達(dá)或僅有弱表達(dá)，而在50 例膠質(zhì)瘤組織中29 例檢測(cè)到Shh、Gli-1 陽(yáng)性表達(dá)，余下21 例Shh、Gli-1 陰性表達(dá)。其中，Shh 在低級(jí)別膠質(zhì)瘤、高級(jí)別膠質(zhì)瘤間對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Gli-1在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)量明顯高于低級(jí)別。RT-PCR 結(jié)果表明：Shh、Gli-1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常腦組織。但是Shh mRNA、Gli-1 mRNA 在高級(jí)別膠質(zhì)瘤、低級(jí)別膠質(zhì)瘤間對(duì)比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明：與正常腦組織對(duì)比，在膠質(zhì)瘤組織中Shh 和Gli-1 在蛋白水平及基因水平均上調(diào)，提示Shh 信號(hào)通路在GBM 細(xì)胞中是普遍激活的。而在不同級(jí)別GBM 細(xì)胞中Gli-1 在蛋白水平表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Ki67 是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，與細(xì)胞增殖活性以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，是我國(guó)中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷與治療指南(2015)強(qiáng)烈推薦的生物學(xué)標(biāo)記物(I 級(jí)證據(jù))[25]。本研究證實(shí)，在GBM 細(xì)胞中Gli-1 高表達(dá)并與Ki-67 呈正相關(guān)，這預(yù)示著腫瘤細(xì)胞的增殖分化能力與Gli-1 有明顯的正相關(guān)性，Gli-1 表達(dá)高的GBM 可能預(yù)示著更加不良的預(yù)后。因此從另一個(gè)層面來(lái)說(shuō)適時(shí)適當(dāng)干預(yù)Gli-1 的表達(dá)，調(diào)節(jié)Shh 信號(hào)通路的激活/失活狀態(tài)將有可能作為治療GBM 的一個(gè)重要手段。

目前有關(guān)Gli-1 及Shh 信號(hào)通路在GBM 方面的研究尚少積極探究GBM 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍然有鎖欠缺，本研究樣本量較少，機(jī)制研究深入程度仍需完善，但也為臨床治療GBM 提供了一定指導(dǎo)意義，為后續(xù)研究打下部分基礎(chǔ)。