蔣桂芝，田 海，陶建祥

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪666100；2.云南天然橡膠產(chǎn)業(yè)集團(tuán)江城有限公司，云南普洱665907）

目前橡膠樹種苗繁育主要采用籽苗芽接的方法，育苗期比過去的實(shí)生苗芽接縮短1年左右。2018年6月，云南景洪橡膠育苗大棚橡膠樹籽苗出現(xiàn)莖腐病：莖病部變黑、壞死還有凝膠，與疫霉（Phytophthorade Bary)引起的橡膠樹季風(fēng)性落葉病葉柄癥狀極為相似（圖1a）。為準(zhǔn)確識(shí)別和防治病害，筆者進(jìn)行了病原分離鑒定，現(xiàn)將鑒定結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

病原材料：采自云南省熱帶作物科學(xué)研究所橡膠研究中心育苗大棚內(nèi)的籽苗病莖。

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，水 1 000 mL。

瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂17 g，水1 000 mL。

皮氏培養(yǎng)液：Ca（NO3）20.4 g，KH2PO40.15 g，Mg（NO3）20.15 g，CaCl 0.06 g，蒸餾水 1 000 mL。

圖1 植株田間感病癥狀、接種癥狀

試驗(yàn)接種材料：由云南省熱帶作物科學(xué)研究所橡膠研究中心提供，為培育10個(gè)月生長(zhǎng)正常的云研77-4籽苗。

1.2 方法

1.2.1 病原分離

切取長(zhǎng)度為5 cm左右的感病組織，經(jīng)75%酒精表面消毒后，用滅菌刀片切取大?。?～5）mm×（3～5）mm病健交界組織，置于PDA平板上，在25℃室溫下培養(yǎng)3 d。長(zhǎng)出菌落后，用滅菌針挑取少量菌絲置于另一個(gè)PDA平板上，在25℃室溫下培養(yǎng)5 d形成菌落，再從中挑取少量菌絲置于瓊脂平板上，在25℃室溫下培養(yǎng)36 h，顯微鏡下進(jìn)行單菌絲分離，在25℃室溫下培養(yǎng)5 d得到純培養(yǎng)菌，用于致病性測(cè)試和形態(tài)鑒定。

1.2.2 致病性測(cè)試

培養(yǎng)好的菌種用滅菌刀片劃成大小約5 mm×5 mm的菌塊備用。將準(zhǔn)備好接種的橡膠籽苗莖干用自來水清洗1次，待莖干上的水分干后，用大頭針在莖干上扎3個(gè)小孔，品字排列，孔距3～5 mm，然后將備好的菌塊有菌絲的一面貼在小孔上，用無菌濕棉保濕2 d，5～7 d后觀察接種點(diǎn)感病情況。當(dāng)接種點(diǎn)出現(xiàn)與田間一致的感病癥狀后再進(jìn)行病原分離，得到與接種菌一致的菌即確認(rèn)為病原菌。

1.2.3 病原鑒定

根據(jù)菌落和孢子囊的形態(tài)特征、適宜溫度，并參照《疫霉菌及其研究技術(shù)》等資料進(jìn)行鑒定。

1.2.3.1 菌落形態(tài)

將純培養(yǎng)菌轉(zhuǎn)接到新PDA平板上，在25℃室溫、自然光照條件下培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)。

1.2.3.2 厚垣孢子形成

將接有病原菌的PDA平板置于25℃、室內(nèi)RH65%、自然光照下培養(yǎng)10～15 d，觀察原垣孢子的形成。

1.2.3.3 孢子囊形成

將凹面玻片用75%的酒精表面消毒，涼干備用。用滅菌針挑取大?。?～3）mm×（2～3）mm的菌塊置于玻片的凹面中，在凹面中加入約3 mL的皮氏培養(yǎng)液，將載有菌塊的玻片置于28℃、自然光照下在培養(yǎng)缸保濕培養(yǎng)1～2 d，觀察孢子囊的形成及形態(tài)特征。

1.2.3.4 適宜生長(zhǎng)溫度測(cè)試

將純培養(yǎng)菌株擴(kuò)繁后，用滅菌打孔器打成直徑5 mm的菌絲塊，將菌絲塊接種在PDA平板上，接種好的PDA 平板分別置于溫度為 5、10、15、20、25、30、33、37℃，RH 80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每個(gè)處理5皿。5 d后用數(shù)顯卡尺測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，依據(jù)各處理菌落生長(zhǎng)量確定病原菌的適宜溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原分離

分離樣本8個(gè)，均得到形態(tài)一致的白色菌落，用滅菌針挑取菌絲鏡檢，確定所得菌落均為同一真菌。選取1個(gè)菌落為代表菌進(jìn)行單菌絲分離培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)菌，編號(hào)為XJZM20180627，用于致病性測(cè)試和病原鑒定。

2.2 致病性測(cè)試

籽苗莖上接種5 d后，在接種部位均出現(xiàn)與田間感病一致的癥狀（圖1b），經(jīng)病原的再分離得到與接種菌一致的菌，確認(rèn)為病原菌。

2.3 病原鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)

PDA平板上的氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌落白色（圖2a、圖2b），菌絲無色，粗細(xì)均勻，菌絲無隔，寬度4.1～5.2 μm。菌絲未見膨大。

圖2 X J Z M 2 0 1 8 0 6 2 7菌落形態(tài)、孢子囊和孢子囊梗、厚垣孢子

2.3.2 厚垣孢子形成

在25℃、室內(nèi)RH65%、自然光照下培養(yǎng)10 d，鏡檢觀察到有厚垣孢子形成，厚垣孢子球形、近球形，頂生或間生，直徑25～38 μm（圖2c）。

2.3.3 孢子囊形態(tài)特征

在25℃、皮氏培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h產(chǎn)生孢子囊。孢子囊梗簡(jiǎn)單合軸分枝，粗2.5～5.2 μm；孢子囊多為梨形、卵形、近圓形，少數(shù)橢圓形，大小（33～58）μm×（30～40）μm，長(zhǎng)寬比 1.1～1.9。孢子囊脫落，具短柄，柄長(zhǎng)1.5～4.3 μm。孢子囊乳突突起明顯，單乳突，偶見雙乳突（圖2d）。

2.3.4 適宜生長(zhǎng)溫度測(cè)試

在 5、10、15、20、25、30、33、37℃，RH 80%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，得到不同溫度菌絲生長(zhǎng)曲線（圖3），可以看出，菌絲生長(zhǎng)范圍為10～33℃，適宜生長(zhǎng)溫度15～30℃，最適生長(zhǎng)溫度為20～25℃，最高生長(zhǎng)溫度＜33℃。

圖1 不同溫度下菌絲生長(zhǎng)曲線

根據(jù)菌落、孢子囊形態(tài)及橡膠籽苗上的病狀，比較鄭小波［1］、余永年等［2］的文獻(xiàn)描述，鑒定該病原菌為棕櫚疫霉Phytophthora palmivoraButler。

3 小結(jié)

棕櫚疫霉P.palmivora是在熱區(qū)廣泛分布的疫霉種，能引起橡膠樹［3］及多種熱帶作物重要病害［4-6］。充分的高濕環(huán)境是疫霉病發(fā)生和流行的必要條件，橡膠籽苗大棚栽培就具備這樣的條件。因此，本病的防治應(yīng)注意：1）適時(shí)調(diào)整、降低大棚內(nèi)的水分和相對(duì)濕度；2）及時(shí)清除病苗；3）必要時(shí)對(duì)病區(qū)籽苗可噴霧甲霜靈、甲霜·霜霉威、疫霉凈等農(nóng)藥，能有效控制本病的發(fā)生。