毛常麗，張鳳良，李小琴，楊 湉，倪書邦，吳 裕

（云南省熱帶作物科學(xué)研究所，景洪666100）

表觀遺傳學(xué)（epigenetics）是研究表觀遺傳變異的遺傳學(xué)分支學(xué)科，表觀遺傳變異（epigenetic variation）是指在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致表型的變化，其主要涉及DNA與染色體上的一些可逆修飾以及一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)控是表觀遺傳學(xué)研究的主要方向，并在植物生長發(fā)育、逆境脅迫或環(huán)境適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用［1-3］。其中，DNA甲基化是基因組DNA的一種最重要的表觀遺傳修飾方式，MSAP技術(shù)是在AFLP技術(shù)上建立起來的［4］，已被廣泛用于檢測植物在高溫［5-9］、低溫［10-12］、干旱［13-15］等非生物脅迫條件下 DNA甲基化水平變化的研究。

橡膠作為重要的物資，是國民、國防不可或缺的資源，天然橡膠是橡膠工業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，其來源主要是巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）。天然橡膠種植材料為橡膠樹芽接苗，橡膠樹的生長、產(chǎn)量與砧木和接穗以及栽種的立地環(huán)境息息相關(guān)。關(guān)于砧木與接穗間的相互影響，已經(jīng)在黃瓜［16］、葡萄［17］、阿月渾子［18］以及番茄［19］等作物上有過研究。在橡膠樹上，砧木與接穗間的研究包括蛋白質(zhì)組學(xué)［20］、徑向生長差異［21］、生化［22］、內(nèi)源激素［23］等。在表觀遺傳學(xué)方面，黃關(guān)青等構(gòu)建了橡膠樹的DNA甲基化過濾文庫［24］；李海林等對橡膠樹全基因組水平DNA甲基化位點(diǎn)進(jìn)行檢測，確定巴西橡膠樹基因組DNA甲基化模式和水平［25］；吳春太等建立了橡膠樹的MSAP反應(yīng)體系，并分析了無性系DNA的甲基化水平［26］。對于橡膠樹砧木與接穗間的甲基化水平如何，至今未見報道。

本研究利用MSAP技術(shù)對巴西橡膠樹砧木與接穗間的全基因組DNA甲基化水平進(jìn)行了分析，為巴西橡膠樹高產(chǎn)育種提供分子輔助手段及理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗設(shè)計說明

從橡膠樹無性系IAN873、GT1和RRIM600的開放授粉子代中各選1株作為采穗原株（分別記為 SI、SG、SR）；同時以這 3 個無性系的半同胞家系為砧木（分別記為RI、RG、RR）。砧木長到地徑約1.5 cm時，在離地30～40 cm高度鋸干，從抽生的新芽中選擇方向相對的兩枝留下，其余抹除。待留下的兩枝長到可嫁接粗度后開始嫁接工作。

圖1 橡膠樹自接和對接

實驗設(shè)計為3個采穗原株與3個家系建立9個砧穗組合（3×3），即得到9株砧木的雙叉植株（圖1）。為了減少嫁接過程本身造成的差異，從砧木本株采一芽片嫁接，稱為“自接”（圖1中，A）；按實驗設(shè)計建立的砧穗組合稱為“對接”（圖1中，B）。

1.2 材料

砧木采樣：在嫁接前，采集砧木 RI、RG、RR的變色期葉片，硅膠干燥保存。自接和對接采樣：嫁接完成后第二年全部鋸干，待自接和對接的芽片都抽生枝條且正常生長到2蓬葉以上，采集其變色期葉片，硅膠干燥保存。即包括9株砧木嫁接前的葉樣、嫁接后自接葉樣和對接葉樣，共27個樣品。

1.3 方法

MSAP實驗委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。采用EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ進(jìn)行酶切，用3730XL測序分析儀（美國ABI公司）對MSAP選擇性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離擴(kuò)增片段，得到的峰圖用Genemapper 4.0軟件進(jìn)行分析。實驗用到的接頭及引物相關(guān)信息見表1。

表1 M S A P分析所用的接頭及引物信息

2 結(jié)果和分析

2.1 橡膠樹砧木嫁接后的甲基化模式

對EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ酶切產(chǎn)物經(jīng)過連接、2輪擴(kuò)增后，用3730XL測序分析儀進(jìn)行檢測，得到MSAP峰圖（圖2、圖3）。將得到的峰圖進(jìn)行轉(zhuǎn)換，得到0/1數(shù)據(jù)（“0”表示擴(kuò)增后無帶，“1”表示擴(kuò)增后有帶）。經(jīng)統(tǒng)計，橡膠樹嫁接后出現(xiàn)以下3種甲基化模式：當(dāng)E+M有帶，E+H無帶時，表明CCGG位點(diǎn)發(fā)生雙鏈DNA內(nèi)甲基化，即全甲基化位點(diǎn)；當(dāng)E+M無帶，E+H有帶時，表明CCGG位點(diǎn)發(fā)生單鏈DNA外甲基化，即半甲基化位點(diǎn)；當(dāng)E+M和E+H都有帶時，表明CCGG位點(diǎn)未發(fā)生甲基化，即非甲基化位點(diǎn)。

圖2 I A N 8 7 3砧木用引物組合E+M擴(kuò)增所得峰圖

圖3 I A N 8 7 3砧木用引物組合E+H擴(kuò)增所得峰圖

2.2 橡膠樹砧木嫁接后的甲基化水平

針對橡膠樹砧木與接穗基因組DNA的甲基化，共選出8對引物進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)轉(zhuǎn)換得到的0/1數(shù)據(jù)，8對引物共擴(kuò)增得到13 922條帶，其中甲基化位點(diǎn)6 862個（表2），甲基化率為49．29%，甲基化位點(diǎn)中全甲基化位點(diǎn)2 859個（41.66%），半甲基化位點(diǎn)4 003個（58.34%）。

表2 橡膠樹砧木甲基化位點(diǎn)

對3種砧木嫁接前后甲基化模式之間的轉(zhuǎn)換進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表3。

表3 橡膠樹嫁接前后的甲基化模式轉(zhuǎn)換

表4 橡膠樹砧木嫁接前后甲基化位點(diǎn)變化

統(tǒng)計以上數(shù)據(jù)，3種接穗嫁接于3種砧木后，以半甲基化與無甲基化間的相互轉(zhuǎn)換為主，而由半甲基化轉(zhuǎn)化為全甲基化或者由全甲基化轉(zhuǎn)化為半甲基化的很少，全甲基化與無甲基化間的轉(zhuǎn)換居中。

根據(jù)以上數(shù)據(jù)，3種接穗嫁接于3種砧木后，對IAN873砧木（RI）的甲基化位點(diǎn)數(shù)的影響為SI＞SG和SR；對GT1砧木的甲基化位點(diǎn)數(shù)的影響為SI/SG＞SR；對IAN873砧木的甲基化位點(diǎn)數(shù)的影響為 SI＞SG∕SR。

3種砧木嫁接前后甲基化變化情況見表4。從表4中的數(shù)據(jù)可以看出，IAN873砧木嫁接IAN873接穗后，甲基化位點(diǎn)數(shù)增加了16個，嫁接GT1接穗后，甲基化位點(diǎn)減少了17個，而RRIM600嫁接到IAN873后引起的甲基化位點(diǎn)數(shù)變化不大；當(dāng)以GT1為砧木時，引起甲基化位點(diǎn)變化較大的接穗是IAN873及GT1，而RRIM600變化不大；當(dāng)以RRIM600為砧木，接穗IAN873使嫁接后的甲基化位點(diǎn)數(shù)下降，而嫁接GT及RRIM600后甲基化位點(diǎn)增加，且RRIM600接穗引起位點(diǎn)數(shù)增加的幅度大于GT1接穗。

3 討論

在植物中，DNA甲基化主要參與植物基因表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育［27］，其主要通過基因的甲基化和去甲基化來調(diào)控基因的表達(dá)。本研究探討了橡膠樹砧木嫁接后的甲基化水平變化，結(jié)果表明：嫁接后砧木的甲基化水平發(fā)生了變化，且同一砧木嫁接不同的接穗引起的甲基化變化有差異；嫁接使砧木的甲基化模式發(fā)生改變，主要以半甲基化與無甲基化間的相互轉(zhuǎn)換為主。

橡膠樹種植材料為嫁接的優(yōu)良無性系，橡膠樹的生長、產(chǎn)量等性狀取決于接穗品種、栽培的立地環(huán)境以及砧木所能提供給樹體的養(yǎng)分情況等，砧木品種的選擇對橡膠樹嫁接及性狀表現(xiàn)至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，嫁接可以改變砧木的甲基化水平及模式。Avramidou等［28］也發(fā)現(xiàn)，嫁接可以引起接穗甲基化水平的改變，使接穗的甲基化水平上升。李海林等［25］對巴西橡膠樹DNA甲基化的位點(diǎn)進(jìn)行分離測序，得到橡膠樹基因組中包括轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶等在內(nèi)的多種類型的DNA序列中均存在甲基化現(xiàn)象。因此，橡膠樹嫁接后，可能在砧木與接穗間有相關(guān)的基因被甲基化或者去甲基化表達(dá)，且在砧木與接穗間相互轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致嫁接對砧木及接穗的影響。而嫁接后砧木與接穗間甲基化及相關(guān)物質(zhì)間轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制還需作進(jìn)一步的實驗進(jìn)行驗證。