施玉萍，劉一賢，李嵐嵐，戴利銘，蔡志英

（云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪666100）

炭疽病是危害我國橡膠樹的一種重要葉部病害，在橡膠生產(chǎn)上的危害僅次于橡膠樹白粉病，導(dǎo)致該病發(fā)生的病原菌主要為膠孢炭疽菌復(fù)合群（Colletotrichum gloeosporioidescomplex）和尖孢炭疽菌復(fù)合群（Colletotrichum acutatumcomplex）［1-2］。橡膠樹炭疽病于1906年在斯里蘭卡被首次發(fā)現(xiàn)，目前該病已廣泛分布于非洲中部、南美洲、亞洲南部和東南部等植膠國家［3］。在我國該病害早期只在苗圃和新植幼樹上少量發(fā)現(xiàn)，1962年在海南大豐農(nóng)場開割膠樹上首次發(fā)現(xiàn)個別品系整年因病落葉，不能割膠，此后在廣東的紅五月農(nóng)場及廣東徐聞、?？祪煽h各農(nóng)場引起不同程度落葉。1992年橡膠炭疽病在暢好農(nóng)場發(fā)生大面積流行，發(fā)病面積1 550.53 hm2，占開割面積75%，受害割株31.2萬株，造成四、五級落葉20多萬株，部分林段的膠樹因落葉多、枝條枯死，開割時間推遲一個半月，也有部分林段因多次受到炭疽病病菌的反復(fù)侵染為害，推遲2～3個月開割，干膠損失達(dá)250 t。近年來，由于大量更新和推廣高產(chǎn)品系，該病發(fā)生日趨嚴(yán)重，1996年僅海南墾區(qū)發(fā)病面積就達(dá)73萬hm2，損失干膠15 000 t。廣西、云南和福建等各植膠區(qū)也陸續(xù)報道其發(fā)生危害情況［4-6］。2004年，橡膠樹老葉炭疽病在云南西雙版納、紅河、普洱、臨滄、德宏和文山等植膠區(qū)不同程度發(fā)生。據(jù)勐養(yǎng)橡膠分公司調(diào)查，2004年8-10月，0.2 hm2橡膠林發(fā)生橡膠老葉炭疽病，病重林地的病情指數(shù)達(dá)3～4級，部分病葉脫落，致使膠乳產(chǎn)量急速下降［7］。

近年來，隨著分子系統(tǒng)學(xué)方法引入炭疽菌屬的分類研究，陸續(xù)有一些橡膠樹上的新發(fā)現(xiàn)病害在國內(nèi)報道發(fā)生，包括C.ledongense、C.australisinense、C.bannanense和C.laticiphilum等［8-9］。由橡膠樹炭疽菌C.laticiphilum引起的橡膠樹葉部病害是我國新發(fā)現(xiàn)為害橡膠葉的一種病原菌，2016年在普洱市孟連增殖苗圃分離獲得。該病原菌的培養(yǎng)形態(tài)、孢子大小及形態(tài)、附著孢大小及形態(tài)方面等都與傳統(tǒng)的尖孢炭疽菌存在很大的差異，經(jīng)進(jìn)一步鑒定，屬于尖孢炭疽菌復(fù)合群，目前國內(nèi)尚無相關(guān)研究報道，對病原菌生物學(xué)特性的研究還處于空白。本文對橡膠炭疽菌C.laticiphilum生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為該病害進(jìn)一步深入研究及防治提供理論基礎(chǔ)。

長期以來，化學(xué)農(nóng)藥在控制病害過程中發(fā)揮了巨大作用，但隨著病菌的抗性產(chǎn)生，藥效降低，生產(chǎn)上對高效低毒藥劑的需求日益迫切。雖然生物防治是抑制病害的一個重要途徑，但實(shí)際應(yīng)用較少，在目前尚無優(yōu)良抗病品種的情況下，化學(xué)防治仍是控制病害流行的主要措施。為此，本研究采用菌絲生長速率法測定了4種常用農(nóng)藥對C.laticiphilum的毒力，以期為該病害的防治提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株來源：橡膠葉病菌（C.laticiphilum）采自云南省普洱市孟連農(nóng)場增殖苗圃，由本項目組分離、鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 18 g，水 1 000 mL)；Czapek 培養(yǎng)基（NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖20 g）；OA（燕麥片瓊脂）培養(yǎng)基（燕麥片 50 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL）；CA（胡蘿卜瓊脂）培養(yǎng)基（胡蘿卜200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL）；CMV（玉米粉瓊脂）培養(yǎng)基（玉米粉40 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL）。

供試藥劑：百菌清可濕性粉劑（有效成分含量75%，蘇州先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）；代森猛鋅可濕性粉劑（有效成分含量80%，北京燕化永樂生物科技股份有限公司）；咪鮮胺水乳劑（有效成分含量450 g/L，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司）；丙環(huán)唑乳油（有效成分含量250 g/L，蘇州先正達(dá)作物保護(hù)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

將病原菌菌株接種到PDA平板上進(jìn)行活化，培養(yǎng)5 d后用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，分別接種到PDA、CA、CMA、OA培養(yǎng)基上，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2 溫度對菌絲生長的影響

病原菌菌株活化后，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于5、10、15、20、22、24、26、28、30、35℃共10個溫度處理下黑暗培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3 pH對菌絲生長的影響

將冷卻至60℃左右的PDA培養(yǎng)基用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)整pH值為 3、4、5、6、7、8、9、10、11并制成 PDA 平板，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到不同pH值的平板上，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 不同碳源對菌絲生長的影響

以葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖、木糖、可溶性淀粉、山梨醇、甘露醇、甘油等11種作為碳源，代替Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖，配制不同碳源培養(yǎng)基，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到不同碳源的培養(yǎng)基平板上，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.5 不同氮源對菌絲生長的影響

以色氨酸、胱氨酸、L-丙氨酸、酪氨酸、L-精氨酸、甘氨酸、酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀等13種作為氮源，代替Czapek培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配制不同碳源培養(yǎng)基，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到不同碳源的培養(yǎng)基平板上，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.6 光照對病原菌生長的影響

設(shè)置24 h黑暗、24 h光照（日光燈15 W）、12 h黑暗/12 h光照（日光燈15 W）3種光照條件。將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于3種光照條件下培養(yǎng)7 d，每個處理重復(fù)3次，觀察菌落生長情況。

1.2.7 病原菌菌絲的致死溫度

將病原菌菌株接種到PDA平板上進(jìn)行活化，培養(yǎng)5 d后在菌落表面滴加2 mL無菌水，用無菌棉棒將菌落表面菌絲磨碎，取菌液置于已滅菌的玻璃試管中，在 45、46、47、48、49、50、52℃恒溫水浴鍋中處理10 min，分別取0.2 mL不同溫度處理的菌液涂板于PDA平板培養(yǎng)基上，以一支在室溫中放置的試管作為對照，每個處理重復(fù)3次，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后觀察菌落生長情況。

1.2.8 病原菌孢子的致死溫度

將病原菌菌株接種到PDA平板上，培養(yǎng)5 d后制備孢子懸浮液，10～15個孢子/視野（10×10倍），取孢子懸浮液置于已滅菌的玻璃試管中，在45、48、50、51、52、54、56、58、60℃恒溫水浴鍋中處理10 min，分別取0.5 mL不同溫度處理的孢子液涂板于PDA平板培養(yǎng)基上，以一支在室溫中放置的試管作為對照，每個處理重復(fù)3次，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后觀察菌落生長情況。

1.2.9 病原菌防治藥劑的篩選

用直徑5 mm的打孔器在病原菌菌落邊緣打取菌餅，接種到含不同濃度殺菌劑的PDA培養(yǎng)基上，每個處理3次重復(fù)，以不含殺菌劑的PDA為對照，28℃培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測量菌落直徑。以藥劑濃度對數(shù)值為橫軸（x），菌落生長抑制率的機(jī)率值（y）為縱軸制作毒力曲線，求出毒力回歸方程：y=ax+b，并計算不同藥劑對病原菌的有效抑制中濃度（EC50）。

菌落生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-5 mm）×100

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS Statistics 24、Origin 8.5數(shù)據(jù)分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響

病原菌在PDA、CA、OA、CMA四種培養(yǎng)基上均能正常生長，PDA培養(yǎng)基上生長最快，7 d后菌落生長直徑達(dá)71.63 mm，PDA、CA培養(yǎng)基上氣生菌絲茂盛，而CMA培養(yǎng)基氣生菌絲稀?。▓D1）。

2.2 溫度對菌絲生長的影響

由圖2可看出，橡膠樹炭疽病病原菌在10～35℃都能生長，5℃不能生長。適宜溫度范圍為22～30℃ ，培 養(yǎng) 7 d 后 菌 落 直 徑 在 59.84～72.72 mm，最適溫度為26℃，培養(yǎng)7 d后菌落直徑達(dá)到72.72 mm，病原菌菌絲在超過30℃時對溫度比較敏感。

2.3 pH對菌絲生長的影響

病原菌菌絲在pH 3～11范圍內(nèi)均能生長，在pH 5～7均有較好長勢，最適生長pH值為6，培養(yǎng)7 d后菌落直徑達(dá)73.11 mm。病原菌對酸堿的適應(yīng)范圍比較廣，但更適宜在酸性環(huán)境下生長（圖3）。

圖1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響及不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

圖2 溫度對菌絲生長的影響

圖3 p H對菌絲生長的影響

圖4 不同碳源對菌絲生長的影響

2.4 不同碳源對菌絲生長的影響

對11種不同碳源進(jìn)行比較之后發(fā)現(xiàn)，病原菌對可溶性淀粉利用最好，菌絲生長較快，培養(yǎng)7 d后菌落直徑達(dá)到62.07 mm，其次是山梨醇，菌落直徑為55.22 mm，含有乳糖、半乳糖的培養(yǎng)基上的病原菌長勢較慢，菌落直徑分別為39.63 mm和32.19 mm（圖4）。

2.5 不同氮源對菌絲生長的影響

由圖5可知，在含有13種不同氮源培養(yǎng)基上，病原菌在含牛肉浸膏的培養(yǎng)基上長勢最快，對氮源的利用率最高，培養(yǎng)7 d后菌落直徑達(dá)到70.65 mm。硫酸銨和氯化銨對病原菌有明顯的抑制作用，菌落直徑分別為16.65 mm和19.45 mm。說明病原菌對有機(jī)氮源和無機(jī)氮源都能利用，有機(jī)氮源更有利于病原菌菌絲的生長。

圖5 不同氮源對菌絲生長的影響

2.6 光照對病原菌生長的影響

觀測結(jié)果表明（表1），24 h光照條件更有利于菌絲生長，并且在光照條件下有利于產(chǎn)生色素。光暗交替的條件更有利于孢子產(chǎn)生，黑暗條件不利于菌絲生長。

表1 光照對病原菌菌絲生長的影響

2.7 病原菌菌絲的致死溫度

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了7個溫度對病原菌菌絲進(jìn)行處理（表2），在溫度45～49℃條件下菌絲均能形成新菌落，在50℃條件下不能形成新菌落，說明病原菌菌絲的致死溫度為50℃，10 min。

表2 病原菌菌絲致死溫度

2.8 病原菌分生孢子的致死溫度

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了7個溫度對病原菌分生孢子懸浮液進(jìn)行處理（表3），在45～49℃處理下分生孢子均能萌發(fā)形成新菌落，在50℃處理下不能形成新菌落，說明病原菌分生孢子的致死溫度為50℃，10 min。

2.9 病原菌防治藥劑的篩選

室內(nèi)毒力測定結(jié)果（表4）表明，4種殺菌劑對病原菌的毒力存在明顯差異，其中咪鮮胺和丙環(huán)唑的毒力最強(qiáng)，EC50分別為0.1286和0.5208 mg/L。供試藥劑毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.9，說明藥劑不同濃度間抑菌率相關(guān)性較高，推算出的EC50較準(zhǔn)確。

表3 病原菌分生孢子致死溫度

表4 不同殺菌劑對橡膠樹炭疽菌的室內(nèi)毒力測定

3 討論

迄今為止，橡膠樹炭疽病C.laticiphilum只在哥倫比亞和印度有報道發(fā)生，但都沒有其生物學(xué)性狀及化學(xué)防治的相關(guān)研究報道。我們在病害調(diào)查過程中首次發(fā)現(xiàn)在我國膠園中存在該病害，且該病害的發(fā)病率高達(dá)86%，嚴(yán)重影響橡膠樹的正常生長。經(jīng)對該病害的生長性狀及防治藥劑進(jìn)行研究，C.laticiphilum在10～35℃都能生長，最適生長溫度為26℃。該病原菌對酸堿的適應(yīng)范圍比較廣，菌絲在pH 3～11范圍內(nèi)均能生長，最適生長pH值為6。菌絲在50℃條件下處理10 min停止生長，分生孢子在50℃條件下處理10 min停止萌發(fā)；通過對11種不同碳源進(jìn)行比較之后發(fā)現(xiàn)，病原菌對可溶性淀粉利用最好，其次為山梨醇，對13種氮源比較后發(fā)現(xiàn)，病原菌在含牛肉浸膏的培養(yǎng)基上長勢最快，對氮源的利用率最高。病原菌在完全光照條件下生長最好，該結(jié)果與前人研究橡膠樹炭疽菌的最適生長溫度、最適酸堿度、碳氮源利用等方面都有所差異［10-15］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該病原菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)對自然環(huán)境的適應(yīng)范圍與我國植膠區(qū)的環(huán)境條件較為一致，是典型的熱帶地區(qū)病原菌。病原菌在我國植膠區(qū)如遇合適的氣候因素很可能會引發(fā)病害的大流行，威脅我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)。因此，有必要對該病害對殺菌劑的敏感性進(jìn)行研究，以便應(yīng)對這種潛在威脅。

咪鮮胺和丙環(huán)唑是一種廣譜殺菌劑，對由子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌引起的病害具有明顯的防效，而百菌清和代森猛鋅是廣譜、非內(nèi)吸保護(hù)性殺菌劑，廣泛用于果樹、蔬菜以及大田作物，可防治多種重要的葉部真菌病害，本研究選用了這4種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明，咪鮮胺、丙環(huán)唑、百菌清、代森猛鋅對病原菌的毒力存在明顯差異，咪鮮胺和丙環(huán)唑的毒力最強(qiáng)，而百菌清和代森猛鋅毒力較弱，該結(jié)果與陳怡志［16］、曹學(xué)仁［17］等對炭疽菌防治藥劑研究結(jié)果一致，而與王蘭英［18］、崔昌華［19］、胡曉穎［20］等的又有所差異。因而對該病菌的防治藥劑篩選也變得尤為重要，只有篩選出有效藥劑才能在實(shí)際生產(chǎn)中指導(dǎo)該病害的防治，起到高效防治病害的作用，同時也避免殺菌劑的濫用。近年來，國內(nèi)外利用微生物制劑、植物源制劑及誘抗劑等對鏈格孢屬真菌引起的植物病害進(jìn)行生物防治，取得了一定的效果。例如日本研發(fā)的多氧霉素和我國研發(fā)的多抗霉素對煙草赤星病、蘋果斑點(diǎn)落葉病具有顯著的效果，張月鳳［21］等研究發(fā)現(xiàn)生防放線菌CY-14發(fā)酵液對香蕉炭疽病具有顯著的防治效果。谷春艷［22-23］等研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌與化學(xué)藥劑復(fù)配能對草莓炭疽病及灰霉病的防治有增效作用。因此，對于橡膠樹葉部病害的防治，在采取傳統(tǒng)化學(xué)藥劑防治的同時，我們也應(yīng)考慮結(jié)合其生物學(xué)特點(diǎn)，積極研發(fā)有效的微生物制劑、農(nóng)用抗生素、微生物與化學(xué)藥劑復(fù)配劑等新型農(nóng)藥。