楊海棠，胡延嶺，李 盼，劉軟枝，廖先靜，朱麗麗，韓華民

(鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所，河南 鄭州 450005)

花生是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，也是河南省第三大作物，種植面積僅次于玉米和小麥。河南省是我國花生種植第一大省，近年來花生種植面積占全國種植面積的23%，產(chǎn)量占全國花生總產(chǎn)的27%[1]。多年來，河南花生研究取得了長足進(jìn)展，促進(jìn)了花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展，但隨著花生生產(chǎn)與市場的變化，花生研究中的一些問題日益突出，例如：專用型品種比較缺乏，難以滿足日趨多元化的市場需求，育種材料遺傳基礎(chǔ)有待進(jìn)一步拓寬[2-4]，種質(zhì)創(chuàng)新與育種技術(shù)研究滯后等，這些問題已成為花生發(fā)展的瓶頸。

在新品種選育中，突破性的品種往往來源于關(guān)鍵遺傳資源的發(fā)現(xiàn)與利用，而這又取決于種質(zhì)的遺傳多樣性和有利基因的頻率。因而，研究花生種質(zhì)資源的遺傳多樣性具有重要意義。對河南省不同類型花生品種(系)的遺傳多樣性進(jìn)行分析、評價(jià)，有利于對現(xiàn)有種質(zhì)資源有明確認(rèn)識(shí)，同時(shí)也可以為花生遺傳資源有效利用和花生新品種選育提供理論依據(jù)。進(jìn)而可以有目的地利用種質(zhì)資源，有計(jì)劃地創(chuàng)造新材料，選育出配合力高、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的資源，組配強(qiáng)優(yōu)勢組合，進(jìn)一步培育優(yōu)良品種。

本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對河南省近年來正在推廣及新選育的60個(gè)包括普通型和珍珠豆型的花生地方品種(系)進(jìn)行遺傳多樣性研究，采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行聚類分析，為有效利用花生遺傳資源和為育種中合理選擇親本提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料從河南省鄭州、濮陽、開封、漯河、商丘、駐馬店等6個(gè)地方相關(guān)育種單位收集的60個(gè)不同植物學(xué)類型的花生品種(系)，類型及來源地詳見表1，其中，分類上屬于普通型花生52個(gè)，珍珠豆型花生8個(gè)。2014年5月份種植在河南鄭州須水試驗(yàn)場，生長期按常規(guī)田間管理進(jìn)行。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

苗期取花生幼葉，與干燥劑一起放入自封袋。取回的樣品放在-80℃冰箱保存。運(yùn)用CTAB法提取花生葉片DNA[5]，用于后續(xù)SSR分析。

1.2.2 SSR分析

根據(jù)前人的研究[6-10]，選擇運(yùn)用200對多態(tài)性較好的SSR引物對60份花生品種(系)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)果運(yùn)用ABI 3500XL設(shè)備進(jìn)行高通量電泳分析，并將電泳結(jié)果根據(jù)特征條帶的分子量大小通過Genographer 2.1軟件轉(zhuǎn)化為模擬條帶，詳細(xì)的操作按照軟件使用說明進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

運(yùn)用R語言程序包R 3.1.2對特征條帶進(jìn)行遺傳距離的轉(zhuǎn)化。運(yùn)用R軟件計(jì)算AMOVA遺傳距離，并運(yùn)用MEGA 6.0軟件中phylogeny下的UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages)進(jìn)行聚類分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)記在品種間的多態(tài)性情況

200對SSR引物在60份花生品種(系)的擴(kuò)增結(jié)果表明，擴(kuò)增結(jié)果為單一條帶的引物為98對，占總引物數(shù)的49%；擴(kuò)增結(jié)果為兩條帶的引物為85對，占總引物數(shù)的42.5%；擴(kuò)增結(jié)果為三條帶的引物為17對，占總引物數(shù)的8.5%。全部200對SSR引物在60份花生品種(系)中有較好的擴(kuò)增效果，均有不同程度的多態(tài)性產(chǎn)生，沒有擴(kuò)增結(jié)果完全相同的引物出現(xiàn)。

2.2 品種間的相似性

根據(jù)SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)計(jì)算60個(gè)品種(系)間的遺傳相似系數(shù)在0到1之間(見表2)，平均值為0.3。其中，開19-2與商花10號和開農(nóng)012相似系數(shù)為1，遺傳相似系數(shù)最大，相似性高。此外，有30個(gè)組合的遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.9，分別為：遠(yuǎn)雜9807與開農(nóng)49、鄭農(nóng)花12號、漯花4087、漯花4016、1004新品系、豫花9331和豫花9925遺傳相似系數(shù)為0.9。商研9958與商花5號和豫花9719遺傳相似系數(shù)為0.9。漯花4016與開農(nóng)49、鄭農(nóng)花12號、豫花9331和豫花9925遺傳相似系數(shù)為0.9。豫花9331與濮花33和豫花9925 遺傳相似系數(shù)為0.9。濮花28與開17-60和商研9958遺傳相似系數(shù)為0.9。開17-70與開農(nóng)0306和鄭農(nóng)花12號遺傳相似系數(shù)為0.9。駐花1號與濮花33遺傳相似系數(shù)為0.9。豫花9327與鄭農(nóng)花12號和豫花9925遺傳相似系數(shù)為0.9。豫花9925與漯花4087遺傳相似系數(shù)為0.9。鄭農(nóng)花13號與開農(nóng)064遺傳相似系數(shù)為0.9。商花5號與豫花25號和豫花9719 遺傳相似系數(shù)為0.9。豫航花3號與豫花9840遺傳相似系數(shù)為0.9。商研9558 與開17-60遺傳相似系數(shù)為0.9。濮花39與金果1號遺傳相似系數(shù)為0.9。說明這些品種(系)間也具有較高的相似性。

遺傳相似系數(shù)為0的組合有374個(gè)。分別為：開農(nóng)012 與其他44個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。開19-2與其他40個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。商花10號與其他40個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。濮花3號與其他37個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。商花511與其他34個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。商花8號與其他34個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。鄭花6號與其他32個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。鄭農(nóng)花15號與其他22個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。遠(yuǎn)雜9102與其他21個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。濮花41與其他17個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。0628-4與其他15個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。豫花9326與其他14個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。豫花15號與其他10個(gè)材料間遺傳相似系數(shù)為0。在實(shí)驗(yàn)分析的1770個(gè)關(guān)系組合中，有616個(gè)遺傳相似系數(shù)大于0.5，說明這些品種(系)間具有較低的遺傳相似性。

表2 60個(gè)花生品種(系)間的遺傳相似系數(shù)

表2 60個(gè)花生品種(系)間的遺傳相似系數(shù) (續(xù)表)

圖 1 各個(gè)品種(系)SSR標(biāo)記聚類圖 Fig. 1 Cluster analysis of peanut genotypes from SSR markers

2.3 聚類分析

圖1可看出，在距離320處，60份花生品種(系)被分成了5大類群，其中第一大類群又分為兩大亞類，亞類I和亞類II各包含16個(gè)品種，亞類I中，包含有鄭州7個(gè)，分別為：鄭農(nóng)花 12號、豫花22號、遠(yuǎn)雜9805、鄭農(nóng)花9號、豫花9925、豫花23號和豫花9327；濮陽2個(gè)，分別為：濮花33 和圣濮花1號；開封4個(gè)，分別為：開農(nóng)07-24，開農(nóng)0306，開17-60和開農(nóng)49；漯河3個(gè)，分別為：漯花4087，漯花1號和漯花8號。亞類II中，包含有鄭州9個(gè)，分別為：遠(yuǎn)雜9847、鄭農(nóng)花13號、豫花25號、黑花生1101、金果1號、鄭農(nóng)花14號、遠(yuǎn)雜9102、豫航花1號和豫花9830；濮陽3個(gè)，分別為：濮花35、濮花40和濮東花1號；開封1個(gè)，為開農(nóng)064；商丘2個(gè)，分別為：商花6號和商花5號；駐馬店1個(gè)，為駐花2號。第二大類群包含8個(gè)品種，其中鄭州5個(gè)，分別為：遠(yuǎn)雜9807、1004新品系、豫花9719、豫花9840和豫航花3號；開封1個(gè)，為開農(nóng)004；漯河1個(gè)，為漯花4016；商丘1個(gè)，為商研9958。第三大類群包含8個(gè)品種，其中鄭州2個(gè)，分別為鄭農(nóng)花7號和豫花聚類獲得的五大類群中，第一類群品種最多，為32個(gè)，第四類群品種最少，為3個(gè)。鄭州育成的品種(系)在五類中均有出現(xiàn)。開封育成的品種(系)在四大類群出現(xiàn)，且第一類的I、II亞類中都有。商丘育成的品種(系)也分別出現(xiàn)在四大類群中，但在第一類群中，僅出現(xiàn)在第II亞類中。來源于濮陽的品種(系)出現(xiàn)在三大類群中，但第一類群的I、II亞類都有。來源于漯河的品種(系)，出現(xiàn)在三大類群中，但在第一類群中，僅出現(xiàn)在第I亞類中。來源于駐馬店的品種(系)，僅出現(xiàn)在兩大類群中，且第一類群僅在第II亞類中出現(xiàn)。

3 討 論

本研究選用河南省鄭州、濮陽、開封、漯河、商丘、駐馬店等6個(gè)地方相關(guān)育種單位選育的近年來正在推廣種植或正在培育的60個(gè)花生品種(系)進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，遺傳相似系數(shù)分析表明，平均值為0.3，在實(shí)驗(yàn)分析的1770個(gè)關(guān)系組合中，僅有616個(gè)組合的遺傳相似系數(shù)大于0.5，說明這60個(gè)品種(系)整體遺傳背景差異較大，這與前人研究表明的花生資源遺傳基礎(chǔ)較窄[2-4]有一定差異?？赡艿脑?yàn)椋阂皇潜狙芯窟x用的材料多數(shù)是不同育種單位近年來收集或者培育的材料，由于目前不同育種單位加強(qiáng)種質(zhì)交流的力度較大，甚至有國外不同類型資源的引入與馴化，以及新種質(zhì)創(chuàng)制的手段也多樣化，例如理化誘變、遠(yuǎn)緣雜交等手段的使用，使得新的花生品種(系)有相對較寬的遺傳基礎(chǔ)[7-10]。

二是由于本研究選用的SSR引物為前人研究[12]已經(jīng)證明有較好多態(tài)性的引物，對不同品種(系)的區(qū)分較為明顯。遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果也表明，開19-2與商花10號和開農(nóng)012相似系數(shù)為1，具有較高的相似性。此外，還有30個(gè)組合的遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.9，因而，在創(chuàng)造新材料，組配雜交組合時(shí)，可以結(jié)合具體的農(nóng)藝性狀。參考上述結(jié)論，應(yīng)盡量回避在遺傳相似系數(shù)高的組合中進(jìn)一步組配選育新材料。

在374個(gè)遺傳相似系數(shù)為0的組合中，開農(nóng)012、開19-2和商花10號與其他品種(系)的相似系數(shù)則較普遍較低，而這三個(gè)品種(系)間卻具有極高的遺傳相似性，說明這三個(gè)品種的遺傳背景比較獨(dú)特，可能其祖先為共有親本，但與其他資源材料又存在較大差異。在后期新雜交組合選配及資源利用中，應(yīng)充分考慮這三個(gè)品種的特性，與其他資源組配合適的組合，培育新的優(yōu)異品種。

聚類分析將60個(gè)品種(系)分成了5大類群，這五大類群中，均含有來源于鄭州的品種。不同地方的品種對五大類群的覆蓋度依次為開封、商丘、濮陽、漯河、駐馬店。來源于駐馬店的品種僅在第一大類群的第II亞類和第三大類群中出現(xiàn)。這種現(xiàn)象與本研究選用的材料數(shù)量有關(guān)，鄭州為28個(gè)，開封、濮陽分別為9個(gè)，商丘為7個(gè)，漯河為5個(gè)，駐馬店為2個(gè)。也與不同地方的花生育種科研人員的數(shù)量與科研實(shí)力有關(guān)，不同地方有一定的差異。在第四類群僅有的三個(gè)品種中，商丘的品種占了兩個(gè)，鄭州占一個(gè)。濮陽的9個(gè)品種中，在第二類群和第四類群中沒有出現(xiàn)。這些也表明不同的育種單位在培育品種的時(shí)候親本來源途徑不盡相同，各有特色。

聚類得到的結(jié)果與遺傳相似系數(shù)分析的結(jié)果有一定的相似性，例如，遠(yuǎn)雜9807與漯花4016遺傳相似系數(shù)為0.9，聚類圖上也距離最近。鄭農(nóng)花12號、漯花4087、豫花9925和開農(nóng)49遺傳相似系數(shù)為0.9，聚類同在第一類群第I亞類。豫花9840與豫航花3號遺傳相似系數(shù)為0.9，聚類圖上也距離最近。開19-2與開農(nóng)012遺傳相似系數(shù)為1，聚類圖上也距離最近。

SSR標(biāo)記是區(qū)分不同花生品種的重要手段[13-22]。在本研究中，所用的多態(tài)性較好的200對SSR引物，能夠基本反映供試品種的多態(tài)性。此外，SSR標(biāo)記TC3A12在鄭農(nóng)花13號與遠(yuǎn)雜9847和豫花9830這三個(gè)品種的擴(kuò)增產(chǎn)物帶型相同，而這三個(gè)品種均為高油品種，已有研究也表明此標(biāo)記與一個(gè)高油的QTL位點(diǎn)緊密連鎖，且該QTL對花生油分含量的遺傳貢獻(xiàn)率為2.89%[23]，這也為新品種利用和高油分含量的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了參考,但這一位點(diǎn)更廣泛的驗(yàn)證工作還有待進(jìn)一步開展。而基于這些多態(tài)性SSR標(biāo)記開展的遺傳多樣性分析，對60個(gè)河南省地方花生品種的遺傳多樣性水平有了詳細(xì)的了解。在育種工作中，可以結(jié)合農(nóng)藝性狀，利用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、遺傳差異大的材料作親本選育優(yōu)良品種。