譚靜，胡秀彩，呂愛軍，孫敬鋒，劉小雪，廉正義

半滑舌鰨黏蛋白基因的克隆與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

譚靜，胡秀彩，呂愛軍通信作者，孫敬鋒，劉小雪，廉正義

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

黏蛋白作為魚類黏液的主要成分，在抵御病原感染過程中發(fā)揮重要作用。以半滑舌鰨（）黏蛋白為研究對(duì)象，采用RT-PCR方法對(duì)其皮膚黏蛋白MUC5AC（即CsMUC5AC）進(jìn)行基因克隆及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。結(jié)果獲得基因片段的長(zhǎng)度為2 771 bp，推測(cè)編碼917個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)所含5個(gè)抗原表位分布在314-321、507-516、578-589、748-762和811-826 aa，3個(gè)結(jié)構(gòu)域主要為C8（164-238，624-698 aa）、VWD（1-128，430-588 aa）和VWC（303-365，768-836 aa）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)C8區(qū)主要由α-螺旋構(gòu)成、VWD區(qū)以β折疊為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白亞基主要由VWD-C8-VWC組成。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，其與大菱鲆、攀鱸、羅非魚黏蛋白MUC5AC親緣關(guān)系較近，與分泌型黏蛋白家族自然聚為一支。以上結(jié)果為研究半滑舌鰨黏蛋白基因功能提供科學(xué)參考。

半滑舌鰨；黏蛋白；基因克??；結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

黏蛋白（）作為機(jī)體黏膜免疫應(yīng)答的主要組分之一，備受關(guān)注[1-3]。對(duì)人類和哺乳動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，黏蛋白與腸炎[1]、支氣管炎[2]及多種癌癥[3]等疾病發(fā)生密切相關(guān)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，魚類易受水體病原微生物感染，主要通過皮膚、鰓和胃腸道等黏膜組織侵入，這些組織中含有黏液細(xì)胞，分泌一種保護(hù)性黏液，其中黏蛋白作為黏液的主要成分，在抵御病原體感染過程中發(fā)揮著重要作用[4]。研究表明，魚類皮膚黏液中含有多種活性物質(zhì)，包括黏蛋白、多糖、免疫球蛋白及酶類等，對(duì)魚類的許多生理、病理功能有著重要影響[5-6]。迄今為止，在人類和高等脊椎動(dòng)物中，已發(fā)現(xiàn)二十多種黏蛋白，其被分為分泌型黏蛋白和膜結(jié)合黏蛋白兩種類型[7]，其中，分泌型黏蛋白一般由上皮杯狀細(xì)胞和黏膜下腺細(xì)胞分泌形成[8]。目前認(rèn)為魚類體表黏液主要由分泌型黏蛋白組成，含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域包括VWD （Von willebrand D）、VWC （Von willebrand C）、C8 （Cysteine 8）、TIL（Trypsin inhibitor-like domain）、PTS（Proline- threonine-serine）等[9]。近幾年，有對(duì)斑馬魚（）[10]、團(tuán)頭魴（）[11]、黃顙魚（）[12]等多種魚類黏蛋白基因克隆及表達(dá)的相關(guān)研究，但目前對(duì)半滑舌鰨黏蛋白基因尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

半滑舌鰨是我國(guó)主要的海水經(jīng)濟(jì)魚類，隨著養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，病害問題也日趨嚴(yán)重[13]。半滑舌鰨作為一種底棲魚類，其體表黏液不僅是物理屏障，而且能防御水體病原侵入，同時(shí)在滲透壓調(diào)節(jié)等生理方面也起一定作用[14]。已有對(duì)鯉（）、黃顙魚基因克隆及特異性表達(dá)的研究，認(rèn)為其在皮膚黏膜免疫應(yīng)答過程中具有重要功能[12，15]。因此，本研究以半滑舌鰨為對(duì)象，對(duì)其皮膚黏蛋白基因克隆，對(duì)其基因編碼序列進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，為今后深入研究基因功能提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)魚

健康半滑舌鰨購(gòu)自天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，體重（110±10）g，取其皮膚組織立即投入液氮冷凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于總RNA提取。

1.1.2 試劑

RNA提取試劑盒（TRIzol Reagent）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、PCR Buffer、pMD18-T載體等試劑購(gòu)自TaKaRa公司。PCR Master Mix體系、UNIQ-10柱式膠回收試劑盒購(gòu)自上海捷瑞公司。無水乙醇、氯仿、異丙醇等為分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)半滑舌鰨基因編碼序列（登錄號(hào)：XM_025055866.1），用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物（表1），引物由蘇州金唯智生物有限公司合成。

表1 半滑舌鰨CsMUC5AC基因引物序列的設(shè)計(jì)

1.2.2 皮膚總RNA提取和cDNA第一鏈合成

參照Neuwirth等[16]的方法，用TRIzol Reagent抽提RNA?？俁NA質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，其濃度及260/280值通過Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)測(cè)定。然后以提取的總RNA為模板，用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）合成第一鏈cDNA，合成的cDNA -20 ℃保存，備用。

1.2.3基因克隆

以RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，3對(duì)特異性引物用于PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物用1%瓊脂糖檢測(cè)，切膠回收，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，孵育、涂板，培養(yǎng)過夜后挑取單克隆，菌液PCR檢測(cè)選取陽性單克隆后送公司測(cè)序。

1.2.4基因序列與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

參照梁昱等[17]描述方法進(jìn)行，采用ORF程序查找序列的開放閱讀框，DNAStar軟件進(jìn)行蛋白抗原性、親水性等理化特性分析，利用ExPASy Protseale、SMART等軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，ClustalW及MEGA 6.0進(jìn)行序列比對(duì)， Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 半滑舌鰨CsMUC5AC基因克隆

以半滑舌鰨皮膚組織cDNA作為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增基因得到3個(gè)目的片段，將其分別亞克隆至pMD18-T載體分別測(cè)序?yàn)?93、1 305、715 bp，拼接獲得片段長(zhǎng)度為2 771 bp，推測(cè)編碼917個(gè)氨基酸（圖1），預(yù)測(cè)分子量為99.30 kD、理論等電點(diǎn)（PI）為4.86，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為37.82、親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.234。DNAStar預(yù)測(cè)CsMUC5AC為親水性蛋白，含有5個(gè)主要抗原表位（314-321、507-516、578-589、748-762、811-826 aa）。

圖1 半滑舌鰨CsMUC5AC基因的引物及編碼氨基酸序列

注：A為CsMUC5AC基因的引物序列，B為CsMUC5AC基因的編碼氨基酸序列，小寫字母為UTR序列，橢圓為起始密碼子，下劃線為引物序列，方框?yàn)樘腔稽c(diǎn)進(jìn)一步對(duì)CsMUC5AC蛋白修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明，CsMUC5AC有1個(gè)糖基化位點(diǎn)（S189），當(dāng)閾值≥0.9時(shí)共有13個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中6個(gè)絲氨酸（Ser）

磷酸化位點(diǎn)（S19/90/96/265/331/627），2個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)（T693/859），5個(gè)酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)（Y166/193/220/269/871）。此外，閾值≤0.5時(shí)，Ser磷酸化位點(diǎn)主要分布在200-400 aa和600-680 aa之間，Thr磷酸化位點(diǎn)主要分布在850-917 aa之間，Tyr磷酸化位點(diǎn)在740-820 aa之間顯著分布。

2.2 MUC5AC多序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對(duì)MUC5AC蛋白序列比對(duì)顯示，含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，主要為VWD （pfam00094，1-128 aa，430-588 aa）、C8（pfam08742，164-238aa，624-698）和VWC（pfam00093，303-365，768-836）（圖2A）。

圖2 CsMUC5AC結(jié)構(gòu)域及不同物種MUC5AC氨基酸序列多重比對(duì)分析

注：A為CsMUC5AC蛋白結(jié)構(gòu)域，B為不同物種MUC5AC氨基酸序列多重比對(duì)；黑色為氨基酸同源性100%，深灰色為氨基酸同源性75%以上；實(shí)粗線方框指VWD結(jié)構(gòu)域，虛線方框指C8結(jié)構(gòu)域，實(shí)細(xì)線方框指VWC結(jié)構(gòu)域；*為半胱氨酸

其中半滑舌鰨CsMUC5AC與大菱鲆（，AWP02052.1）同源性最高，為68.52%，其次為攀鱸（，XP_026234507.1），為67.60%，與羅非魚（，XP_019210361.2）和雪鯛（，XP_024655160.1）的同源性分別為66.32%和64.69%。其與人（，AGR44427.1）、小鼠（，XP_006508562.1）、雞（，XP_025006868.1）和非洲爪蟾（，XP_018113011.1）同源性分別為50.75%、51.68%、51.80%和51.22%，MUC5AC蛋白序列比對(duì)結(jié)果見圖2B。

進(jìn)一步選擇人、鼠、大菱鲆、攀鱸、羅非魚等18個(gè)黏蛋白基因序列，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示半滑舌鰨CsMUC5AC與大菱鲆親緣關(guān)系較近，自然聚為一支，屬于分泌型黏蛋白家族，并且與膜結(jié)合型黏蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖3）。

圖3 鄰接法構(gòu)建不同物種黏蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 CsMUC5AC蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)CsMUC5AC蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，表明以β-折疊為主，其中C8區(qū)主要由α-螺旋構(gòu)成，VWD、VWC區(qū)主要由β折疊構(gòu)成（圖4A）。三級(jí)結(jié)構(gòu)有2個(gè)蛋白亞基，主要由VWD-C8-VWC結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，且與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基本一致（圖4 B）。

圖4 CsMUC5AC蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

注：A為CsMUC5AC蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，圓柱為α-螺旋，箭頭為β折疊；B為CsMUC5AC蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

魚類皮膚及黏液是先天免疫反應(yīng)的第一道防線，其中黏蛋白不僅抑制細(xì)胞表面與病原結(jié)合，而且刺激細(xì)胞吞噬作用[18]。研究表明，黏蛋白家族主要有分泌型黏蛋白（MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6和MUC19）和膜結(jié)合型黏蛋白（MUC1、MUC3、MUC4、MUC12、MUC13、MUC14、MUC15、MUC16、MUC17和MUC18）[19]。對(duì)人類和哺乳動(dòng)物研究表明，黏蛋白與多種疾病發(fā)生密切相關(guān)，主要分泌呼吸道黏蛋白為MUC5AC和MUC5B[1-3]。Pérez-Sánchez等[20]報(bào)道分泌型黏蛋白為動(dòng)物上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、修復(fù)和存活提供防御作用，且在免疫應(yīng)答中發(fā)生表達(dá)變化。Mejías-Luque等[21]對(duì)幽門螺桿菌感染小鼠胃腸黏膜MUC2、MUC4和MUC5AC等黏蛋白表達(dá)變化研究，提示MUC5AC是胃癌發(fā)生蛋白標(biāo)志物之一。Matsukita等[22]發(fā)現(xiàn)MUC5AC黏蛋白表達(dá)水平與人乳腺癌有關(guān)。Imai等[23]發(fā)現(xiàn)MUC5AC在結(jié)直腸癌患者中顯著性上調(diào)表達(dá)。黏蛋白作為魚類機(jī)體黏膜免疫應(yīng)答主要組分之一，對(duì)其基因克隆及功能研究備受關(guān)注[11，15，24]。Marel等[15]對(duì)鯉、基因克隆表達(dá)研究，表明在皮膚中顯著性上調(diào)表達(dá)，而在鰓和腸道中顯著性差異表達(dá)。薛春雨等[11]對(duì)團(tuán)頭魴基因克隆及表達(dá)分析，表明捕撈應(yīng)激后在皮膚和鰓中含量差異表達(dá)。Duan等[24]對(duì)南美白對(duì)蝦（）、和基因表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)外界壓力脅迫下分泌型黏蛋白基因表達(dá)變化顯著。目前，未有對(duì)半滑舌鰨黏蛋白基因克隆表達(dá)研究的報(bào)道。本研究對(duì)半滑舌鰨皮膚黏蛋白CsMUC5AC基因克隆，并對(duì)其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行序列和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，為深入研究基因功能打下基礎(chǔ)。

對(duì)分泌型黏液蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，基因蛋白具有特定的C8、VWD結(jié)構(gòu)域序列，且富含PTS重復(fù)序列[11]。本研究獲得CsMUC5AC黏蛋白基因推測(cè)編碼917個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)含有保守結(jié)構(gòu)域VWD（pfam00094）、C8 （pfam08742）和VWC（pfam00093），這與鯉、團(tuán)頭魴等文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11，15]。研究表明，黏蛋白VWD、C8和VWC結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守，且與黏液蛋白基因類型及功能密切相關(guān)[9]。同時(shí)，用黏蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析顯示半滑舌鰨CsMUC5AC屬于分泌型黏蛋白家族，且與大菱鲆、鱸等魚類黏蛋白親緣關(guān)系較近。魚類分泌型黏蛋白基因功能有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)半滑舌鰨皮膚黏蛋白基因克隆與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明CsMUC5AC屬于分泌型黏蛋白，主要由VWD-C8- VWC模式構(gòu)成蛋白亞基，并對(duì)其糖基化、磷酸化位點(diǎn)及主要抗原表位分析，為深入研究魚類黏蛋白基因功能奠定基礎(chǔ)，對(duì)魚類疾病免疫預(yù)防研究具有重要意義。

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Cloning and sequence analysis of mucingene from the half-smooth tongue sole,

TAN Jing, HU Xiu-cai, Lü Ai-junCorresponding Author, SUN Jing-feng, LIU Xiao-xue, LIAN Zheng-yi

（Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

As the main component of fish mucus, mucin plays an important role in protecting from pathogen infection. The MUC5AC gene of, namely CsMUC5AC gene was cloned by RT-PCR method and protein structure was predicted by bioinformatics analysis. Results showed that the length of thegene fragment was 2 771 bp, encoding 917 amino acids（aa）, and 5 antigenic epitopes were predicted to be mainly located within 314-321, 507-516, 578-589, 748-762 and 811-826 aa sites. The 3 domains including C8（164-238, 624-698 aa）, VWD（1-128, 430-588 aa）and VWC（303-365, 768-836 aa）were observed. Analysis of secondary structure showed that the C8 motif was α-helix, the VWD domain was β-sheet, and the tertiary structure was two subunits profiles（VWD-C8-VWC）. The phylogenetic tree analysis showed that CsMUC5AC was closely related tothat of,and, and naturally clustered into one group with the secretory mucins. These results provide a scientific reference for the further study ofgene function in tongue sole.

; MUC5AC; gene cloning; structure prediction

S917.4

A

1008-5394（2019）02-0051-06

10.19640/j.cnki.jtau.2019.02.012

2019-01-27

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（18JCYBJC29900，16JCZDJC33500）；天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（TJAE201803）；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（ITTFRS2017009）；天津農(nóng)學(xué)院綜投平臺(tái)項(xiàng)目（J01009030638）

譚靜（1995-），女，碩士在讀，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物與免疫學(xué)的研究。E-mail：1109849082@qq.com。

呂愛軍（1973-），男，教授，博士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物與免疫學(xué)的研究。E-mail：lajand@126.com。

責(zé)任編輯：張愛婷