邱妍川 ，劉 陽 ，鐘 玲 ，楊宗發(fā) △

（1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶 401331； 2.重慶藥友制藥有限責任公司，重慶 401121）

左氧氟沙星可用于治療呼吸道、泌尿道、皮膚和軟組織感染[1-3]。其市售口服劑型以片劑、膠囊劑為主，將其制成新劑型胃漂浮緩釋微丸，可延長藥物在胃中的停留時間，使藥物在胃中充分釋放，提高胃部疾病的局部療效；同時，因該劑型可增加藥物在胃及小腸上部的吸收，穩(wěn)定血藥濃度，故可提高其口服生物利用度[4-6]。為進一步提高該制劑療效，本研究中給予大鼠灌胃自制左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸，并建立了測定大鼠血漿中左氧氟沙星質(zhì)量濃度的超高效液相色譜（UPLC）法?，F(xiàn)報道如下。

1 動物、儀器與試藥

1.1 動物

清潔級SD大鼠，雌雄各半，6周齡，體質(zhì)量為150～200 g，飼料為基礎(chǔ)飼料，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，使用許可證號為SYXK（渝）2017-0023。

1.2 儀器

1290型超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XS205DU型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；IKA Vortex Genius 3型渦漩混合儀（德國IKA公司）；移液器（德國Eppendorf公司）；Allegra X-22R Centrifuge型多功能臺式高速低溫離心機（美國Beckman公司）。

1.3 試藥

左氧氟沙星對照品（批號為130455-201607，純度97.3%），環(huán)丙沙星對照品（批號為130451-201203，純度84.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；左氧氟沙星原料藥（浙江國邦藥業(yè)有限公司，批號為160809，純度＞99%）；左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸（自制）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersACQUITYUPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），配置同填料類型的保護柱；流動相：0.05mol／L 磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈（75∶25，V／V）；流速：0.3mL／min；柱溫：30℃；進樣量：1μL；檢測波長：294nm。

2.2 溶液制備

稱取左氧氟沙星對照品20.55 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲使溶解，再用甲醇定容，搖勻，作為對照品溶液。稱取環(huán)丙沙星對照品10.12 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為內(nèi)標貯備液，精密移取5 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，作為內(nèi)標溶液。

2.3 血樣處理

取6只SD大鼠，試驗前禁食12 h，灌胃自制左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸（40 mg／kg）。分別于給藥后0.25，0.5，1，2，4，8，12，24 h 時眼眶取血 0.3 mL，置肝素化塑料離心（EP）管中，5000r／min 離心 10min，取血漿，置-20℃冰箱中低溫保存。精密量取大鼠血漿100 μL，置1.5mLEP管中，加入內(nèi)標溶液50μL和甲醇300μL，渦旋0.5 min，1.2×104r／min 離心 5 min，取上清液，氮氣吹干，加入流動相100μL使殘渣溶解，即得空白血漿樣品。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：分別取空白血漿樣品，空白血漿+對照品+內(nèi)標，給藥12 h后的血漿樣品+內(nèi)標進樣，記錄色譜圖。結(jié)果見圖 1。可見，左氧氟沙星與內(nèi)標環(huán)丙沙星分離良好，保留時間分別為3.0 min和3.9 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾左氧氟沙星的分離和測定，表明專屬性良好。

圖1 超高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取不同質(zhì)量濃度的左氧氟沙星對照品溶液各50 μL，置不同的1.5 mL EP管中，氮氣吹干，加入空白血漿100 μL，配成含左氧氟沙星分別為 0.20，0.50，1.00，5.00，10.00，12.00，15.00 μg／mL的含藥血漿樣品，照2.3項下方法處理樣品后按2.1項下色譜條件進樣分析，以血漿質(zhì)量濃度（C）為橫坐標、左氧氟沙星與內(nèi)標的峰面積之比（R）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程R=12.018C+0.848，r=0.999 4（n=7）。結(jié)果表明，血漿中左氧氟沙星質(zhì)量濃度的線性范圍為0.20～15.00 μg／mL。大鼠血漿中左氧氟沙星檢測限為 0.20 μg／mL，RSD為 4.6%（n=7）。

相對回收率試驗：分別用2.3項下處理好的空白血漿樣品與對照品溶液配制高、中、低質(zhì)量濃度和定量限質(zhì)量濃度（12.00，5.00，0.50，0.20 μg／mL）的血漿樣品，按2.1項下色譜條件進樣分析，按線性回歸方程計算各質(zhì)量濃度的實測值。質(zhì)量濃度實測值除以理論值的百分比即為相對回收率。結(jié)果見表 1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n=6）

提取回收率試驗：精密量取不同質(zhì)量濃度的左氧氟沙星對照品溶液50 μL，置不同EP管中，氮氣吹干，加入空白血漿100 μL，按2.3項下方法處理，制得高、中、低質(zhì)量濃度及定量限質(zhì)量濃度水平（12.00，5.00，0.50，0.20 μg／mL）的提取回收率供試品溶液。按2.1項下的色譜條件進樣分析，結(jié)果平均提取回收率介于80.61%～85.44%（n=6），詳見表 1。

精密度試驗：精密吸取空白血漿100 μL，置1.5 mL EP管中，加入對照品貯備液及甲醇適量，制成含左氧氟沙星分別為 12.00，5.00，0.50，0.20 μg／mL 的高、中、低及定量限4個質(zhì)量濃度水平的血漿樣品，每個質(zhì)量濃度配制6份，按2.3項下方法處理，進樣1 μL，同一樣品，1 d內(nèi)測定6次，計算日內(nèi)變異；同一樣品，每天測定1次，連續(xù)測定6 d，計算日間變異。結(jié)果見表 2。

表2 精密度試驗結(jié)果（n=6）

穩(wěn)定性試驗：依法制備高、中、低質(zhì)量濃度的血漿樣品，分別考察室溫放置12 h，-20℃條件下冷凍12 d，血漿樣品3次凍融后再處理的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，測得左氧氟沙星質(zhì)量濃度與真實質(zhì)量濃度的偏差均小于15%，表明樣品在3種條件下均能保持穩(wěn)定。詳見表 3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n=6）

2.5 藥-時曲線與藥代動力學參數(shù)

灌胃給予大鼠自制左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸，其平均藥-時曲線見圖 2。以3P87軟件計算藥代動力學主要參數(shù)。結(jié)果半衰期（t1／2）為（7.51 ±1.04）h，藥 -時曲線下面積（AUC0-t）為（119.73 ±11.34）μg／（mL·h），達峰時間（tmax）為（2.62 ±0.79）h，峰質(zhì)量濃度（Cmax）為（7.91 ±1.45）μg／mL。

圖2 平均藥-時曲線（n=6）

3 討論

在血樣處理時，采用了加甲醇去除蛋白的方法，并與固液萃取法對比，發(fā)現(xiàn)均能較好地去除色圖譜中內(nèi)源性雜質(zhì)對左氧氟沙星測定的干擾，但固液萃取操作較復(fù)雜[7]，且成本更高，因此選擇了前法；左氧氟沙星生物樣品中藥物質(zhì)量濃度的測定方法采用了內(nèi)標法，且選擇結(jié)構(gòu)相似的環(huán)丙沙星作為內(nèi)標物，因環(huán)丙沙星具有相似的回收率，避免了處理過程中主藥回收率偏低的問題。

目前，左氧氟沙星生物樣品檢測以高效液相色譜法居多[8-11]，但本試驗中選用了超高效液相色譜法，左氧氟沙星出峰快，流動相流速低，大大縮短了檢測時間，減少了流動相的使用，提高了試驗效率，節(jié)約了成本。另外，有文獻采用超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測，雖也縮短了檢測時間，但成本過高，操作煩瑣，因此選用UPLC法測定更具有優(yōu)勢[12-13]。

該分析測定中配備了高靈敏度檢測器，檢測器流通池光程為60 mm，比普通檢測器的流通池光程大6倍，靈敏度大大提高。選用了Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱，左氧氟沙星色譜峰對稱性好，峰寬較窄，柱效較高。本試驗中還考察了不同流動相比例對左氧氟沙星質(zhì)量濃度檢測的影響，當流動相中磷酸二氫鉀緩沖液與乙腈的比例為75∶25（V／V）時，分離情況最好。

綜上所述，本研究中建立的UPLC法簡單、快速、靈敏、準確，適用于大鼠血漿中左氧氟沙星的藥代動力學研究。