霍雨薇，丁雨，朱國念，吳思思

四川大學(xué)華西醫(yī)院 a.精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究中心，b.公共實驗技術(shù)中心，四川 成都 610041

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是泌尿外科最常見的疾病之一，由于BPH的高發(fā)病率及對生活質(zhì)量的嚴(yán)重影響，尤其是老年男性患者[1-2]，因此對BPH的治療一直是臨床研究的重點之一。研究顯示，前列腺增生是上皮和基質(zhì)成分混合增生的疾病。前列腺腺體可以分為上皮和基質(zhì)兩部分，這兩個部分在正常前列腺體積中所占比例約為1∶2，隨著年齡的增加，前列腺的基質(zhì)細(xì)胞逐漸增多，而上皮細(xì)胞逐漸減少。所以基質(zhì)增生為最主要的病理特征，在BPH的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[3-5]。BPH發(fā)病過程緩慢，而構(gòu)建動物模型耗時、耗力。前列腺原代基質(zhì)細(xì)胞（primary stromal cell，PSC）離體時間短，遺傳性狀和體內(nèi)細(xì)胞相似，適于做細(xì)胞形態(tài)、功能和分化等研究[6]，此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，所以培養(yǎng)前列腺PSC不但可以模擬BPH體內(nèi)環(huán)境，而且成本較低，因而成為目前BPH基礎(chǔ)研究的重要模型[7]。前列腺PSC原代培養(yǎng)成功率低，生存時間短，傳代次數(shù)少，其中分離提取的前列腺PSC貼壁性差、增殖率低是最大瓶頸。且因為樣本來源于臨床老年患者，手術(shù)方式多為經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)，導(dǎo)致細(xì)胞活性低，爬出量極少。為此，我們在借鑒國內(nèi)外學(xué)者研究方法的基礎(chǔ)上，對3種不同的前列腺PSC培養(yǎng)方法進(jìn)行了探索研究，最后確立一種胰酶消化組織塊貼壁培養(yǎng)前列腺PSC的方法，為獲取PSC提供更為簡便的途徑。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科2016-12～2017-08因良性前列腺增生經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)手術(shù)標(biāo)本，供者年齡均大于70歲。所有前列腺標(biāo)本均經(jīng)病理檢查診斷為良性前列腺增生，排除前列腺癌、膀胱移行細(xì)胞癌前列腺組織浸潤等病變。

1.2 材料

澳洲特級胎牛血清（CLARK Bioscience公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）；青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）、胰蛋白酶（Hyclone公司）；平滑肌α肌動蛋白抗體（Abcam公司）；波形蛋白抗體（武漢艾美捷科技有限公司）。

1.3 取材及預(yù)處理

手術(shù)室無菌條件下切取新鮮良性前列腺增生組織標(biāo)本，置于無血清培養(yǎng)基中，冰上快速運至實驗室。提前配制含青霉素（200 IU/mL）、鏈霉素（200 μg/mL）的雙抗PBS緩沖液（僅用于組織預(yù)處理），在超凈工作臺中用眼科剪小心剪去電切燒焦、毛細(xì)血管等部分，用PBS緩沖液沖洗3次。

1.4 組織塊法

取高溫滅菌后的安瓿瓶，將預(yù)處理后的組織放入安瓿瓶中，剪切至1 mm3大小，分別將組織塊以間距5 mm左右均勻鋪于培養(yǎng)皿（預(yù)先用含雙抗的培養(yǎng)基潤洗底部）中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后加入1 mL DMEM高糖完全培養(yǎng)基（含20%特級胎牛血清、雙抗溶液），24 h后補(bǔ)加完全培養(yǎng)基至正常量。

1.5 膠原酶消化法

配置消化液［12 mgⅠ型膠原酶（1 mg/mL），0.6 mg DNA酶（0.1 mg/mL）］、終止液［無血清培養(yǎng)基DMEM，EDTA（2 mmol/L）］。組織樣本經(jīng)預(yù)處理后，剪切至1 mm3大小，加入3倍組織體積的消化液，37℃振蕩消化10 min，800～1000 r/min離心去上清液，在組織塊中加入新消化液，37℃振蕩消化30～40 min，加入終止液終止消化，離心收集上清液，400 r/min離心，棄上清收集細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基（DMEM高糖+20%胎牛血清+雙抗）重懸，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 胰酶消化組織塊貼壁法

組織樣本經(jīng)預(yù)處理后，剪切至1 mm3大小,加入3倍組織體積的0.25%胰蛋白酶，于37℃恒溫水浴箱內(nèi)振蕩消化10 min，瞬時離心棄上清后，再加3倍組織體積的0.25%胰蛋白酶，再次消化10～20 min，消化至組織塊一經(jīng)搖動即成細(xì)胞團(tuán)塊則認(rèn)為消化充分。800 r/min離心3 min去除上清中的膠質(zhì)團(tuán)塊并棄上清，加少量培養(yǎng)基重懸，以間距5 mm左右將組織塊接種至培養(yǎng)皿（接種可用槍尖或鑷子輕鋪，培養(yǎng)皿預(yù)先用血清浸潤處理），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，沿培養(yǎng)皿壁緩慢加1 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后補(bǔ)加完全培養(yǎng)基至正常量。

1.7 細(xì)胞傳代

培養(yǎng)至第2周，胰酶消化組織塊貼壁法中組織塊周圍細(xì)胞游出及增殖量已達(dá)到培養(yǎng)皿的80%左右，進(jìn)行第1次原代細(xì)胞傳代。吸去培養(yǎng)基，用含雙抗的PBS清洗2次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶于37℃消化，顯微鏡下觀察，當(dāng)呈現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時，加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心3 min，吸去上清，加入新的完全培養(yǎng)基重懸，按1∶3接種至新培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

1.8.1 細(xì)胞凍存液配制 DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10%DMSO（9∶1），4℃預(yù)冷備用。

1.8.2 細(xì)胞的凍存 待胰酶消化組織塊貼壁法中傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長到對數(shù)期時進(jìn)行凍存，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察，當(dāng)呈現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時，加入等體積培養(yǎng)基終止消化，收集至離心管中并計數(shù)。1000 r/min離心5 min，吸去上清液，加入凍存培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞最終密度為5×106～10×106/mL。輕輕混勻后加入1 mL懸液于無菌凍存管，將凍存管放入程序降溫盒中，-80℃凍存過夜，次日將凍存管轉(zhuǎn)入液氮凍存。

1.8.3 細(xì)胞的復(fù)蘇 從液氮中快速取出凍存管，在37℃水浴鍋內(nèi)盡快融化，吸出細(xì)胞懸液至離心管，加入5倍以上體積的培養(yǎng)液，混勻后800 r/min離心3 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿中，放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。細(xì)胞生長至3 d后進(jìn)行傳代。

1.9 前列腺PSC免疫熒光鑒定

對胰酶消化組織塊貼壁法培養(yǎng)的第2代細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定。取3.0×104細(xì)胞接種至24孔板中，制備細(xì)胞爬片；PBS浸洗爬片3次；加4%多聚甲醛固定爬片30 min，PBS浸洗爬片3次，4 min/次；加 0.2%Triton X-100室溫通透 3 min，PBS浸洗爬片3次，3 min/次；3%牛血清白蛋白室溫封閉 30 min，PBS浸洗爬片 3次，3 min/次；加400 μL小鼠抗波形蛋白抗體（1∶500）及兔抗平滑肌α肌動蛋白抗體，4℃過夜，PBS洗3次，3 min/次；加400 μL FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，室溫1 h，避光，PBS 洗 3次，3 min/次；DAPI（1∶1000）染細(xì)胞核1 min，PBS洗4次；防熒光淬滅劑封片，熒光正置顯微鏡成像。

1.10 前列腺PSC增殖曲線測定

取第3代細(xì)胞，以約1.0×104/孔接種于24孔板，每天取3孔細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)基，加0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，用血球計數(shù)板計數(shù)貼壁細(xì)胞，取3孔細(xì)胞計數(shù)的平均值作為該時間組的細(xì)胞數(shù)目。連續(xù)計數(shù)7 d，記錄并繪制生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 不同原代培養(yǎng)方法的比較

圖1A為膠原酶消化法的原代細(xì)胞，貼壁細(xì)胞少，狀態(tài)差；圖1B是采用組織塊貼壁法培養(yǎng)14 d后得到的細(xì)胞，細(xì)胞游出速度較慢，細(xì)胞量少且未展開貼壁；圖1C、D為采用胰酶消化組織塊貼壁法培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞量，細(xì)胞透明度高，折光性強(qiáng)，形態(tài)均一，呈長梭形。

10 d細(xì)胞生長至瓶底的70%～80%，進(jìn)行1∶2傳代，3 d左右細(xì)胞即可融合成片。細(xì)胞多呈長梭形，融合后呈纖維狀排列（圖2A）。細(xì)胞狀態(tài)好，予以凍存，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率約為80%（圖2B）。本實驗傳到第3代，細(xì)胞狀態(tài)較好。

圖1 不同方法培養(yǎng)人前列腺PSC顯微圖像

圖2 細(xì)胞傳代及復(fù)蘇顯微圖像

2.2 原代前列腺PSC純度鑒定

選取第3代前列腺PSC進(jìn)行免疫熒光鑒定，平滑肌α肌動蛋白與波形蛋白染色均為陽性（圖3），顯微鏡下隨機(jī)選擇5個不同區(qū)域計數(shù)陽性細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)之比，結(jié)果顯示，獲取的第3代前列腺PSC純度為95.3%±2.4%。

圖3 前列腺PSC免疫熒光鑒定

2.3 前列腺PSC增殖活力測定

由于胰酶消化組織塊法的原代細(xì)胞與第2代培養(yǎng)的前列腺PSC內(nèi)混雜有少量上皮細(xì)胞，因此僅對純化后的第3代PSC進(jìn)行生長曲線分析[8-9]。血球板計數(shù)法連續(xù)7 d計數(shù)PSC的增殖能力，結(jié)果見圖4。生長前2 d細(xì)胞增殖較少，提示PSC在此時間段增殖能力較弱；2～4 d增殖變化比前2 d顯著（P＜0.05），提示此段時間內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)增殖，處于對數(shù)生長期；5～7 d增殖停滯，與理性的實驗細(xì)胞生長曲線一致。

圖4 前列腺PSC生長曲線

3 討論

良性前列腺增生以中老年男性為高發(fā)群體，是引起排尿障礙的最常見病因。BPH可導(dǎo)致患者尿道延長、受壓變形以及尿道阻力增加，使得膀胱內(nèi)壓升高，繼而引起排尿期、儲尿期相關(guān)癥狀，甚至造成上尿路功能及結(jié)構(gòu)損害，臨床出現(xiàn)下尿路梗阻癥狀，雖然其屬于良性病變，但嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[10]。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳特性，能最接近和反映體內(nèi)生長特性[11-12]。為了解BPH疾病的發(fā)病機(jī)理，建立一種高效可行的人前列腺基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法尤為重要。

臨床來源的組織，因其組織位置、離體后儲存、長距離運輸，極易被微生物污染，且術(shù)中采用的電切術(shù)可致組織表面部分呈焦?fàn)?，增加了污染風(fēng)險，加大了實驗難度，因此需要快速取出且放入無菌緩沖液中運至實驗室進(jìn)行原代分離培養(yǎng)。本實驗所用組織來源于經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)的患者，大部分組織表面呈焦?fàn)?，此部分?xì)胞已無法進(jìn)行分離培養(yǎng)，需用眼科剪將焦?fàn)畈糠朱畛儆煤p抗的PBS清洗3～4次，然后進(jìn)行組織塊的剪切和消化操作，最后加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)多批次、長時間摸索，既規(guī)避了因污染導(dǎo)致原代培養(yǎng)失敗的可能性，使細(xì)胞生長狀況得到改善，同時也使細(xì)胞數(shù)目增多、生長周期縮短。

據(jù)有關(guān)資料顯示，多數(shù)國家統(tǒng)計表明組織學(xué)上增生發(fā)生率與年齡成正相關(guān)，其發(fā)生幾率幾乎是50歲以上50%、60歲以上60%、70歲以上70%、80歲以上80%～100%[13]。實驗中的臨床組織來源患者均大于70歲，由于年齡較大，使得組織活性較低，細(xì)胞爬出速度慢，細(xì)胞量極少，很難獲得非惡性和高度分化的基質(zhì)細(xì)胞株[14]。本研究結(jié)果表明，預(yù)處理后的組織先進(jìn)行胰酶消化，能使組織內(nèi)部細(xì)胞變得松散，便于細(xì)胞游離出，縮短培養(yǎng)周期；胰酶消化后將組織塊貼壁培養(yǎng)，貼壁較牢，不易脫落且易于細(xì)胞游離出，采用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，可使細(xì)胞游出更快、得率更高。

通過設(shè)計系列對照實驗，采用胰酶消化組織塊貼壁法、完全培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)了人前列腺基質(zhì)細(xì)胞，所得細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且能夠進(jìn)行傳代，為后續(xù)研究提供了簡單易行的方法。