劉 楊，趙向絨，余鵬博2，郭春艷，李 研，趙彭花，胡 軍

柯薩奇病毒A 16(Coxsackievirus A16)屬于小核糖核酸病毒科(Picornaradae)，無包膜單股正鏈RNA病毒，基因組約7.4 kb，病毒顆粒呈20面體立體對(duì)稱球形結(jié)構(gòu)。CA16和EV71是引起手足口病的主要病原體， 5歲以下兒童普遍易感，臨床表現(xiàn)為手、足、口部皰疹和皰疹性咽峽炎等癥狀，少數(shù)患者可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎等并發(fā)癥，大多研究認(rèn)為CA16主要引起輕癥感染，但是也有報(bào)道CA16患者中可出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[1-2]。因此，CA16早期快速檢測(cè)和診斷尤為重要，目前用于CA16檢測(cè)技術(shù)主要包括病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。此次研究主要是通過CA16病毒大量培養(yǎng)，利用氯化銫密度梯度離心技術(shù)純化病毒顆粒，以純化的病毒抗原作為免疫抗原制備特異性抗CA16單克隆抗體，在單抗基礎(chǔ)上建立CA16膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法，為臨床快速診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1病毒培養(yǎng) 用DMEM/F12 1∶1(含10%胎牛血清，購(gòu)于Hyclone)培養(yǎng)基培養(yǎng)RD細(xì)胞，待長(zhǎng)至單層后，PBS洗細(xì)胞3次，加入DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基(含1%胎牛血清)，接種CA16病毒液(CA16病毒株為本中心實(shí)驗(yàn)室分離株)，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變情況(CPE)，待細(xì)胞病變達(dá)到75%時(shí)收獲病毒培養(yǎng)上清，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2病毒顆粒純化 收獲的病毒培養(yǎng)上清反復(fù)凍融3次(-70 ℃～37 ℃)，3 000 r/min離心20 min,收集上清后用0.45 μm濾膜過濾，收集濾液20 000 r/min 7 ℃離心4 h(HITACHI)，PBS重懸并溶解病毒沉淀。依次加入重氯化銫梯度液(密度=1.45 g/mL)、輕氯化銫(密度=1.19 g/mL，含結(jié)晶紫染料)、病毒重懸液。20 000 r/min 7 ℃離心4 h。收取藍(lán)色病毒分離層，4 ℃條件下用透析袋對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行透析。純化產(chǎn)物-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3透射電鏡觀察病毒顆粒 取福爾馬林滅活的病毒樣品滴加到銅網(wǎng)上，10 min后取銅網(wǎng)置于2%磷鎢酸溶液中負(fù)染10 min，銅網(wǎng)在燈上烤干后進(jìn)行透射電鏡觀察(HITACHI，H-600)。

1.4單克隆抗體的制備 CA16病毒純化產(chǎn)物用福爾馬林滅活(1/4 000),腹腔免疫BALB/c小鼠(雌性，8周齡，體重18～20 g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。間隔2周加強(qiáng)免疫，融合前3 d，腹腔追加免疫。無菌取免疫小鼠脾臟研磨并與Sp2/0細(xì)胞混合，用 50% PEG4000溶液進(jìn)行細(xì)胞融合，將融合細(xì)胞加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，用HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，用間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，篩選的陽性孔按有限稀釋法亞克隆，建立mAb細(xì)胞株。1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)陽性雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞一部分凍存作為細(xì)胞種子，一部分腹腔內(nèi)注射BALB/c小鼠(腹腔內(nèi)注射0.2 mL石蠟油后10 d的小鼠)，注射量為 0.2 mL(1.25×104個(gè)細(xì)胞)，10 d左右收集腹水。

1.5單克隆抗體反應(yīng)特性鑒定 抗體類和亞類的鑒定，按照Southern biotech公司mAb亞型鑒定試劑盒說明書進(jìn)行。抗體效價(jià)的測(cè)定，用建立的ELISA方法檢測(cè)，對(duì)單抗腹水依次做倍比稀釋，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，同時(shí)用Sp2/0細(xì)胞腹水作陰性對(duì)照。單克隆抗體的特異性和交叉反應(yīng)性鑒定，分別將CA16抗原、EV71抗原、柯薩奇病毒B3型(CB3)、ECHO11抗原(本實(shí)驗(yàn)室分離病毒株)、胎牛血清、RD細(xì)胞碎片等不同抗原包被ELISA板，分別加入單克隆抗體，檢測(cè)與抗原是否有交叉反應(yīng)性。

1.6免疫熒光試驗(yàn) 預(yù)先在12孔培養(yǎng)板中無菌放入載玻片，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔 滴加RD細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后接種CA16病毒，設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照孔，待接種CA16病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)到50%時(shí)棄去上清，加入4%多聚甲醛室溫固定1 h，PBST洗3次，加入抗CA16單克隆抗體，37 ℃孵育1 h，PBST洗6次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(購(gòu)于Thermo Scientific)， 37 ℃避光孵育1 h，PBST洗6次，加入Hoechst 33342(Invirogen)室溫避光染細(xì)胞核20 min，PBST洗6次，置熒光顯微鏡下觀察。

1.7細(xì)胞免疫化學(xué)試驗(yàn) 預(yù)先在12孔培養(yǎng)板中無菌放入載玻片，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔 滴加RD細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后分別接種CA16、EV71病毒，設(shè)立正常細(xì)胞對(duì)照孔，待接種病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)50%～75%時(shí)棄去上清，用10%甲醛室溫固定1 h，PBST洗3次，加入3% 過氧化氫溶液室溫孵育20 min，5% 牛血清白蛋白37 ℃孵育1 h，加入抗CA16單克隆抗體，37 ℃孵育1 h，PBST洗6次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(購(gòu)于Thermo Scientific)， 37 ℃孵育1 h，PBST洗6次，DAB顯色5 min，PBST洗6次，加入蘇木素室溫染色10 min，分化、返藍(lán)后置顯微鏡下觀察。

1.8細(xì)胞ELISA 以1×104個(gè)細(xì)胞/孔 滴加RD細(xì)胞懸液至96孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞貼壁后分別接種0.1、1、10、100和1000 TCID50的CA16，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上清，加入甲醇與丙酮等量混合的固定液室溫固定細(xì)胞 30 min，加入過氧化氫尿素溶液 室溫靜置20 min，5% 牛血清白蛋白37 ℃孵育1 h，加入抗CA16單克隆抗體，37 ℃孵育1 h，PBST洗6次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(購(gòu)于Thermo Scientific)，PBST洗6次，加入TMB顯色液，37 ℃孵育10 min，加入2 mol/L H2SO4終止液，測(cè)定酶標(biāo)板孔吸光度450 nm值(OD450)。

1.9金標(biāo)抗體液的制備 向膠體金顆粒溶液中加入30%的雙氧水，磁力攪拌10 min，加0.2 mol/L的碳酸鉀，攪拌10 min，加入純化的單克隆抗體0.2 mg，攪拌60 min，加入牛血清白蛋白0.1 g；攪拌10 min，加入聚乙二醇0.01 g；攪拌30 min。8 000 r/min離心10 min濃縮金標(biāo)抗體。用膠體金稀釋液溶解(膠體金稀釋液組成：牛血清白蛋白1%,蔗糖2.5%；吐溫-20 0.05%；磷酸緩沖液0.01 mol/L，pH7.4；疊氮鈉0.1%)。

1.10膠體金試紙條組裝 用噴金儀在金標(biāo)墊上均勻鋪上金標(biāo)抗體，烘干。用點(diǎn)膜儀將純化的單抗以2.5 mg/mL的濃度噴入反應(yīng)膜上(檢測(cè)線)，將山羊抗小鼠IgG(購(gòu)于Thermo Scientific)以1 mg/mL的濃度噴入膜上(對(duì)照線)，室溫晾干，即制備出反應(yīng)膜。將樣品墊、金墊、反應(yīng)膜、吸收墊、背襯等部分組裝成膠體金免疫層析試紙條。

1.11膠體金免疫層析試紙條的特異性和敏感性分析 用組裝的膠體金試紙條分別對(duì)CA16培養(yǎng)上清、EV71培養(yǎng)上清和柯薩奇病毒B3進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)。用PBS對(duì)108.25TCID50/0.1 mL的CA16病毒株進(jìn)行倍比系列稀釋，分別用膠體金試紙條對(duì)每個(gè)稀釋度的CA16病毒樣品進(jìn)行檢測(cè)，觀察并收集結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1病毒培養(yǎng)和純化 收獲病毒培養(yǎng)產(chǎn)物，經(jīng)超離濃縮和氯化銫密度梯度超速離心純化后，CA16病毒顆粒處于輕氯化銫梯度液與重氯化銫梯度液之間，同時(shí)，結(jié)晶紫將病毒顆粒染成藍(lán)色，可見藍(lán)色病毒層(圖1)。

圖1 氯化銫密度梯度離心純化CA16病毒顆粒Fig.1 Purification of the CA16 virus by cesium chloride density gradient ultracentrifugation

2.2透射電鏡觀察 福爾馬林滅活的CA16病毒顆粒經(jīng)透射電鏡觀察顯示，病毒顆粒呈二十面體立體對(duì)稱球形結(jié)構(gòu)，直徑大約20～30 nm之間，大小均勻，同時(shí)，有空心病毒顆粒(圖2)。

圖2 透射電鏡觀察純化的CA16病毒顆粒(250 000×)Fig.2 Photographs of CA16 viral particles as analyzed by transmission electron microscopy(250 000 ×)

2.3單克隆抗體制備和特性分析 CA16病毒純化產(chǎn)物滅活后免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾臟研磨與SP2/0細(xì)胞融合，篩選出1株分泌抗CA16單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名mAb CA16-19。免疫熒光試驗(yàn)顯示(圖3)，該株單抗特異性與CA16病毒反應(yīng)。用間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)10-5。抗體亞型ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，單抗為IgG2a亞型。單抗交叉反應(yīng)性結(jié)果顯示，單抗與EV71、CB3和ECHO11病毒均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

圖3 mAb CA16-19細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)(400×)Fig.3 Immunofluorescent assay of mAb CA16-19(400 ×)

2.4細(xì)胞免疫化學(xué)染色 細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示，mAb CA16-19 與CA16感染RD細(xì)胞結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)有棕色著色，mAb CA16-19 不與EV71感染RD細(xì)胞組和正常RD細(xì)胞組結(jié)合，免疫化學(xué)染色只有藍(lán)色細(xì)胞核著色(圖4)。

A：CA16感染RD細(xì)胞組；B：EV71感染細(xì)胞組；C：正常RD細(xì)胞對(duì)照組。圖4 mAb CA16-19 細(xì)胞免疫化學(xué)染色(400×)Fig.4 Cell immunochemical staining of mAb CA16-19(400×)

2.5細(xì)胞ELISA 細(xì)胞ELISA中，推測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶影響ELISA特異性檢測(cè)，因此，用不同濃度過氧化氫尿素處理細(xì)胞板。正常RD細(xì)胞組ELISA檢測(cè)顯示，不同濃度過氧化氫尿素處理組間吸光度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.581，P>0.05)。CA16感染RD細(xì)胞組ELISA檢測(cè)顯示，CA16感染RD細(xì)胞后，不同濃度過氧化氫尿素處理組間吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.153，P<0.01)，6 000 mg/L組與0 mg/L 組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.429，P<0.01)，其他組與0 mg/L 組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。細(xì)胞ELISA表明，細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶對(duì)細(xì)胞ELISA吸光度值影響較小，但當(dāng)過氧化氫尿素濃度為6 000 mg/L時(shí)，可降低吸光度值，而當(dāng)過氧化氫尿素濃度在0～1 500 mg/L間時(shí)，對(duì)ELISA吸光度值無影響(圖5)。細(xì)胞ELISA中可不用進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶處理。不同病毒滴度的CA16感染RD細(xì)胞24 h后，隨著病毒滴度增加，吸光度值也顯著增加。此次細(xì)胞ELISA的臨界值或Cut off=2.1×N，當(dāng)病毒滴度為0(正常細(xì)胞對(duì)照)時(shí)對(duì)應(yīng)的吸光度值為N，Cut off=2.1×N=2.1×0.12=0.252，利用mAb CA16-19建立的細(xì)胞ELISA最低檢測(cè)線為10 TCID50(圖6)。

過氧化氫尿素濃度(mg/L)圖5 不同濃度過氧化氫尿素溶液控制細(xì)胞ELISA細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶比較Fig.5 Comparison of different concentrations of urea peroxide to inhibit endogenous peroxidases in cell-based ELISA

病毒滴度(TCID50)圖6 不同病毒滴度感染RD細(xì)胞后利用mAb CA16-19 通過ELISA檢測(cè)分析Fig.6 Analysis of RD cells infected with different virus titers were detected by ELISA utilizing mAb CA16-19

2.6膠體金免疫層析試紙條的特異性和敏感性分析 利用前期制備的mAb CA16-10[3]標(biāo)記膠體金，將mAb CA16-19單抗用點(diǎn)膜機(jī)噴入反應(yīng)膜上作為檢測(cè)線，組裝膠體金免疫層析試紙條，用組裝的膠體金試紙條對(duì)CA16、EV71和柯薩奇病毒B3進(jìn)行特異性檢測(cè)試驗(yàn)，僅CA16病毒培養(yǎng)上清可在檢測(cè)線和質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，EV71和柯薩奇病毒B3培養(yǎng)上清只在質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶(圖7)。用試紙條分別對(duì)不同稀釋度的CA16樣品進(jìn)行檢測(cè)，在3.125×106.25TCID50/0.1 mL稀釋度的檢測(cè)線上出現(xiàn)較弱紅色條帶，質(zhì)控線清晰可見，而在6.25×106.25TCID50/0.1mL稀釋度的檢測(cè)線和質(zhì)控線均有明顯紅色條帶，因此，該膠體金試紙條的檢測(cè)限為6.25×106.25TCID50/0.1 mL(圖8)。

A：EV71培養(yǎng)上清；B：柯薩奇病毒B3培養(yǎng)上清。圖7 膠體金免疫層析試紙條的特異性分析Fig.7 Specificity analysis of colloidal gold immunochromatographic assay

A:2.5×107.25TCID50/0.1 mL;B:1.25×107.25TCID50/0.1 mL;C:6.25×106.25TCID50/0.1 mL;D:3.125×106.25TCID50/0.1 mL;E:1.56×106.25TCID50/0.1 mL;F:7.8×105.25TCID50/0.1 mL;G:3.9×105.25TCID50/0.1 mL。圖8 膠體金免疫層析試紙條的靈敏性分析Fig.8 Sensitivity analysis of colloidal gold immunochromatographic strips

3 討 論

CA16和EV71引起的手足口病已成為我國(guó)較為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，對(duì)疑似患者進(jìn)行早期檢測(cè)，及早給予治療措施顯得非常重要。而在人群中及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染患者并采取防控措施，可大大降低疾病流行和暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此，建立CA16的早期快速檢測(cè)方法非常重要。目前CA16的檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)，其中病毒分離培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是病毒分離周期長(zhǎng)，操作需要二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)培訓(xùn)等因素，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。血清學(xué)檢測(cè)中，常用中和試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，主要檢測(cè)血清中特異性IgM和IgG，中和試驗(yàn)需要采集急性期和恢復(fù)期血清樣本，不能進(jìn)行早期診斷，多用于血清流行病學(xué)研究。傳統(tǒng)微量中和試驗(yàn)周期長(zhǎng)，需要特定的實(shí)驗(yàn)室，而Hou W[4]等在此基礎(chǔ)上建立了酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)中和試驗(yàn)，縮短試驗(yàn)周期，可用于抗CA16中和抗體測(cè)定。ELISA檢測(cè)血清特異性IgM的方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)條件要求不高，檢測(cè)成本相對(duì)廉價(jià)[5]，可作為有效的檢測(cè)手段。近幾年已被用于臨床診斷中,Gao C等[6]人通過基因工程技術(shù)分別重組表達(dá)了各腸道病毒VP1蛋白，建立ELISA方法并對(duì)人群不同腸道病毒感染血清抗體進(jìn)行檢測(cè)與分析，描述人群血清流行病學(xué)情況。ELISA檢測(cè)IgM時(shí)，由于EV71與CA16以及其他腸道病毒存在抗體交叉反應(yīng)，而影響檢測(cè)特異性，在結(jié)果分析時(shí)需注意[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病毒分子診斷技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其中基于CA16病毒VP1基因序列設(shè)計(jì)的引物和探針已建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time PCR)和RT-PCR，靈敏性和特異性均較高，可檢測(cè)到數(shù)個(gè)拷貝的病毒，以及多重聯(lián)合擴(kuò)增方法可同時(shí)檢測(cè)CA16 和其他腸道病毒[8]?；蛐酒夹g(shù)(Microchip Assay)對(duì)多重病原體聯(lián)合檢測(cè)，適用于大樣本分析[9]，有力的提高了病毒感染檢測(cè)的效率，但該技術(shù)從核酸提取到結(jié)果分析步驟較多，并容易出現(xiàn)交叉污染。本研究利用密度梯度離心法純化病毒顆粒，免疫小鼠制備抗CA16特異性單抗，并評(píng)價(jià)單抗在細(xì)胞ELISA和免疫化學(xué)染色試驗(yàn)中的作用，同時(shí)，以單抗為材料建立膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。

氯化銫密度梯度離心純化技術(shù)純化CA16病毒顆粒時(shí)，由于密度梯度離心后病毒層為白色條帶，不易完全回收。因此，在密度梯度離心前將結(jié)晶紫加入輕密度梯度液中，在離心力的作用下，病毒顆粒由上層低密度區(qū)域向下層高密度區(qū)域移動(dòng)過程中，低密度梯度液中的結(jié)晶紫會(huì)將病毒顆粒染成藍(lán)色，當(dāng)病毒到達(dá)等密度區(qū)域后逐漸形成藍(lán)色病毒區(qū)帶，這樣便于回收病毒層。病毒顆粒電鏡下呈現(xiàn)二十面體立體對(duì)稱球形結(jié)構(gòu)，并可觀察到空心病毒顆粒與完整病毒顆粒。另外，蔗糖密度梯度離心技術(shù)也可用于CA16的純化，并可將空心病毒顆粒與完整病毒顆粒分離開[10],CA16與EV71一樣，均可用蔗糖密度梯度離心分離成2種不同浮密度的顆粒[11]，但是蔗糖的粘度系數(shù)較氯化銫高，離心時(shí)間較長(zhǎng)。由于本研究主要為了獲得病毒抗原，無需將空心病毒顆粒和完整病毒顆粒分開，所以采用氯化銫梯度離心純化方法。Kattur Venkatachalam AR等[12]通過弱離子交換層析獲得高純度EV71病毒顆粒，除此之外，目前用于腸道病毒純化的方法還有凝膠過濾與離子交換結(jié)合及親和層析等技術(shù)[13-14]，純化的病毒蛋白純度高，但回收效率稍低于密度梯度離心。也可先用液相層析系統(tǒng)純化病毒，然后用蔗糖密度梯度離心純化，這樣將層析技術(shù)與密度梯度離心技術(shù)相結(jié)合，獲得病毒顆粒更純，并可經(jīng)蔗糖密度梯度離心將空心病毒顆粒與完整病毒顆粒分離，兩種方法的結(jié)合可顯著提高病毒純度，但病毒回收率與單獨(dú)層析法相比下降20%[15]，所以，應(yīng)根據(jù)具體要求選擇合適的純化方法。

此次純化病毒顆粒滅活后免疫小鼠篩選出1株分泌抗CA16特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株，mAb CA16-19為IgG2a亞型,效價(jià)為10-5。此次制備的mAb CA16-19可用于細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)、細(xì)胞免疫化學(xué)染色試驗(yàn)，可用于CA16病毒感染機(jī)制或抗原表位的研究。同時(shí)也通過mAb CA16-19 建立了細(xì)胞ELISA方法，可在病毒感染RD細(xì)胞后24 h進(jìn)行檢測(cè)，由于ELISA吸光度值較直接觀察細(xì)胞病變效應(yīng)更客觀，因此，細(xì)胞ELISA可用于快速中和試驗(yàn)。與此同時(shí)，利用前期制備的mAb CA16-10標(biāo)記膠體金，將mAb CA16-19單抗用點(diǎn)膜機(jī)噴入反應(yīng)膜上作為檢測(cè)線，組裝膠體金免疫層析試紙條，并對(duì)其敏感性和特異性分析，試紙條可與CA16培養(yǎng)上清特異反應(yīng)，與EV71和柯薩奇病毒B3不發(fā)生交叉反應(yīng)，最低檢測(cè)限為6.25×106.25TCID50/0.1mL。因此，該方法較病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，無需其他設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)，10 min內(nèi)肉眼可判定結(jié)果，可用于臨床快速檢測(cè)和流行病學(xué)現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。Zhang J等[16]也用膠體金免疫層析法分別檢測(cè)抗EV71和CA16的IgM抗體，與PCR和ELISA比較均顯示有較高的靈敏度，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但由于病原體較血清抗體出現(xiàn)早，病原體檢測(cè)對(duì)早期篩檢略勝一籌。

綜上，本研究通過密度梯度離心法純化出CA16病毒顆粒，成功制備出抗CA16特異性單克隆抗體，該抗體可用于細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)、細(xì)胞免疫化學(xué)試驗(yàn)及細(xì)胞ELISA中，并初步建立了膠體金免疫層析檢測(cè)法，為CA16病原學(xué)研究及快速檢測(cè)提供幫助。由于本中心實(shí)驗(yàn)室腸道病毒株種類有限，未能全面進(jìn)行試紙條交叉反應(yīng)性分析。下一步還將采集CA16感染患兒咽拭子和糞便樣本進(jìn)行臨床樣本檢測(cè)分析，繼續(xù)優(yōu)化膠體金試紙條，提高檢測(cè)靈敏度和特異度，為臨床早期診斷和治療提供重要依據(jù)。