耐藥結(jié)核病的發(fā)生和流行成為結(jié)核病控制的重要障礙和急待解決的世界性嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。2007年全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)肺結(jié)核的耐多藥率為8.32%，據(jù)此估計(jì)，我國(guó)耐多藥結(jié)核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)患者達(dá)12萬例，約占全球1/4～1/3，居全球第2位[1]。傳統(tǒng)的結(jié)核病藥敏檢測(cè)方法至少需要2～3月的時(shí)間，遠(yuǎn)不能滿足臨床早期診斷的需要，早期耐藥性診斷技術(shù)的突破是當(dāng)前控制耐藥結(jié)核病的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1材料 本研究共調(diào)查了2010-2016年福州市各區(qū)縣疾控中心收治的262例涂陽肺結(jié)核患者，分離培養(yǎng)出262株分枝桿菌，經(jīng)傳統(tǒng)PNB和TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定246株為結(jié)核分枝桿菌，16株為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。標(biāo)準(zhǔn)菌株H37 RV由國(guó)家參比室惠贈(zèng)。

1.2培養(yǎng)、菌種鑒定和耐藥檢測(cè)方法 按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]規(guī)定進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)、菌種初步鑒定，采用WHO/IUATLD《結(jié)核病耐藥監(jiān)測(cè)指南》[6]推薦的比例法對(duì)INH和RIF進(jìn)行耐藥檢測(cè)。

1.3 MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)

1.3.1提取DNA 取1～2個(gè)菌落懸于300 μL無菌水中，振蕩混勻， 95 ℃加熱滅活20 min，超聲波裂解15 min。12 000 g離心5 min，取5 μL上清液作為DNA模板用于PCR擴(kuò)增。

1.3.2擴(kuò)增 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s、58 ℃ 2 min，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 25 s、53 ℃ 40 s、 70 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；70 ℃ 8 min，1個(gè)循環(huán)。

1.3.3雜交 根據(jù)Geno Type MTBDRplus assay試劑盒說明書進(jìn)行操作。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和變性裂解液DEN 20 μL混勻加入雜交反應(yīng)板，孵育5 min。在全自動(dòng)雜交儀GT-BLOT48上根據(jù)廠家設(shè)定的步驟進(jìn)行操作。雜交后，將試紙條取出置于吸水紙上干燥，然后粘貼在判讀表上。

1.3.4判讀 MTBDRplus雜交試紙條可分為4個(gè)區(qū)，27個(gè)反應(yīng)條帶(見圖1)。第1區(qū)為對(duì)照質(zhì)控帶，有3個(gè)質(zhì)控帶，分別是CC帶，AC帶和TUB帶。CC帶(標(biāo)記物質(zhì)控)反映探針試條上標(biāo)記物結(jié)合并與定位反應(yīng)的有效性，AC帶(擴(kuò)增質(zhì)控)用于確認(rèn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否成功，TUB帶用于確認(rèn)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；第2-4區(qū)為耐藥基因探針區(qū)：第2區(qū)是與RIF耐藥相關(guān)的rpoB基因探針組，第3、4區(qū)分別是與INH耐藥相關(guān)的katG和inhA基因探針組。判讀時(shí)，試紙條上所有野生條帶顯色不顯色為敏感菌株；野生條帶有缺失，突變條帶無論是否顯色均判為耐藥。

1.3.5統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)兩種方法在結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)中的比較采用配對(duì)四格表資料的卡方檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kappa值對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)(Kappa值≥0.75為一致性較好，Kappa值在0.4～0.75為一致性一般，Kappa值≤0.4時(shí)為一致性差)，利用陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值對(duì)檢測(cè)方法應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)NTM和結(jié)核分枝桿菌菌株結(jié)果 246株結(jié)核分枝桿菌TUB條帶均顯陽性，表明是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(見圖1編號(hào)2-13和15的試紙條)，與PNB和TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定結(jié)果100%符合；16株非結(jié)核分枝桿菌TUB條帶缺失，表明未檢出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(見圖1編號(hào)14的試紙條)，與PNB和TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定結(jié)果100%符合。利用MTBDRplus 技術(shù)可以很好的區(qū)分NTM和結(jié)核分枝桿菌。

注：N，陰性對(duì)照；1，結(jié)核分枝桿菌H37Rv；2-15，分枝桿菌臨床分離株。圖1 GenoType MTBDRplus 技術(shù)雜交結(jié)果Fig.1 Hybridization assay results of GenoType MTBDRplus

2.2MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)RIF和INH耐藥性結(jié)果 在本次研究中，利用傳統(tǒng)羅氏藥敏技術(shù)檢測(cè)246株結(jié)核分枝桿菌，單耐RIF的菌株共計(jì)12株，單耐INH的菌株共計(jì)18株，耐多藥菌株共計(jì)8株，全敏感菌株共計(jì)224株。

以傳統(tǒng)羅氏藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus檢測(cè)RIF耐藥性的靈敏度和特異度分別為91.7%和99.6%，陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為91.7%和99.6%，如表1所示。傳統(tǒng)羅氏藥敏方法和MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)RIF的耐藥率均為4.9%，在福州地區(qū)用這兩種方法檢測(cè)RIF耐藥比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.500，P=0.48>0.05)，兩種方法結(jié)果一致性較好(Kappa=0.912)。

以傳統(tǒng)羅氏藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus檢測(cè)INH耐藥性的靈敏度和特異度分別為83.3%和95.2%，陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為57.7%和98.6%，見表1。傳統(tǒng)羅氏藥敏方法檢測(cè)INH的耐藥率為7.3%，MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)INH耐藥率為10.6%，在福州地區(qū)用這兩種方法檢測(cè)INH耐藥比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.500，P=0.061>0.05)，兩種方法結(jié)果一致性一般(Kappa=0.652)。

表1 MTBDRplus檢測(cè)結(jié)果與羅氏藥敏結(jié)果比較
Tab.1 Comparison the results of MTBDRplus test with those of Lwenstein-Jensen culture plus drug susceptibility

羅氏藥敏結(jié)果MTBDRplus結(jié)果RIFINH耐藥敏感耐藥敏感耐藥1111511敏感12333217合計(jì)1223418228

2.3MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株katG和inhA基因突變 以傳統(tǒng)羅氏藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)INHkatG耐藥基因突變靈敏度和特異度分別為77.8%和99.6%，陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為93.3%和98.3%，見表2。傳統(tǒng)羅氏藥敏方法檢測(cè)INH的耐藥率為7.3%，MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)katG耐藥基因突變率為10.6%，在福州地區(qū)用這兩種方法檢測(cè)INH耐藥比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.800，P=0.371>0.05)，兩種方法結(jié)果一致性較好(Kappa=0.838)。

以傳統(tǒng)羅氏藥敏為金標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)INHinhA耐藥基因突變靈敏度和特異度分別11.1%和95.6%，陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為16.7%和93.2%，見表2。傳統(tǒng)羅氏藥敏方法檢測(cè)INH的耐藥率為7.3%，MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)inhA耐藥基因突變率為4.9%。在福州地區(qū)用這兩種方法檢測(cè)INH耐藥比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.962，P=0.327>0.05)，兩種方法診斷結(jié)果一致性較差(Kappa=0.079)。

表2 MTBDRplus檢測(cè)katG和inhA基因突變引起耐藥與羅氏藥敏結(jié)果比較
Tab.2 Comparison the MTBDRplus detection results ofkatGandinhAgene mutation caused drug resistance with those of Lwenstein-Jensen culture plus drug sensitivity

羅氏藥敏結(jié)果MTBDRplus結(jié)果katGinhA耐藥敏感耐藥敏感耐藥141210敏感422716218合計(jì)1822818228

2.4MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)rpoB基因突變區(qū)域分布情況 在12例rpoB基因存在突變的結(jié)核分枝桿菌中，7例(58.3%)存在rpoB基因S531L突變，其中1例(8.3%)rpoB基因野生型WT2和WT7同時(shí)缺失，提示存在rpoB基因511和526兩個(gè)位點(diǎn)突變；1例(8.3%)rpoB基因野生型WT3和WT4同時(shí)缺失，提示存在D516Y或515缺失；各有1例(8.3%)存在rpoB基因526位點(diǎn)突變、531位點(diǎn)突變和H526D突變，見表3。在6例耐多藥結(jié)核分枝桿菌中，3例(50%)存在rpoB基因S531L突變。

表3 MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)rpoB基因突變區(qū)域分布
Tab.3 Detection of mutation site distribution inrpoBgene by MTBDRplus

MTBDRplus 檢測(cè)分析菌株數(shù)rpoB突變位點(diǎn)結(jié)果(%)△WT2 △WT7511和526突變RIFr1(8.3)△WT8 MUT3S531LRIFr6(50)RIFs1(8.3)△WT7526突變RIFr1(8.3)△WT3 △WT4D516Y或515缺失RIFr1(8.3)△WT8531突變RIFr1(8.3)△WT7 MUT2BH526DRIFr1(8.3)合計(jì)RIFr /RIFs12

注：WT是野生探針；MUT是突變探針；RIFr是利福平耐藥；RIFs是利福平敏感；△是缺失。

2.5MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)katG和inhA基因突變區(qū)域分布情況 26例katG和inhA基因存在突變的結(jié)核分枝桿菌中， 57.7%(15/26)存在katG基因315突變，這些315位點(diǎn)突變菌種93.3%(14/15)均為INH耐藥菌株；42.3%(11/26)菌種存在inhA基因C15T位點(diǎn)突變，這些C15T位點(diǎn)突變菌株僅9.1%(1/11)為INH耐藥菌株；有1例菌株同時(shí)存在katG和inhA基因突變，見表4。

表4 MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)katG和inhA基因突變區(qū)域分布
Tab.4 Detection of mutation site distribution ofkatGandinhAby MTBDRplus

MTBDRplus 檢測(cè)分析菌株數(shù)katGinhA突變位點(diǎn)結(jié)果(%)△WT mut1WTS315T1INHr10(38.5)mut1WTS315T1INHr2(7.7)mut1mut3AS315T1 T8CINHr1(3.8)△WTWTS315TINHs1(3.8)△WT mut2WTS315T2INHr1(3.8)WT△WT1 mut1C15TINHs10(38.5)WT△WT1 mut1C15TINHr1(3.8)合計(jì)INHr /INHs26

注：WT是野生探針；mut是突變探針；INHr是異煙肼耐藥；INHs是異煙肼敏感；△是缺失

3 討 論

結(jié)核病是我國(guó)政策規(guī)定的重大傳染病之一，由于藥物的不恰當(dāng)使用耐藥結(jié)核病患病率急劇上升，而耐藥結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)方法的使用對(duì)控制耐藥結(jié)核病的傳播具有重要意義。MTBDRplus技術(shù)是近年來發(fā)展起來基于PCR擴(kuò)增和雜交的方法，用于檢測(cè)特定基因的堿基突變，從而診斷結(jié)核分枝桿菌的耐藥性。其檢測(cè)相比培養(yǎng)表型分析具有明顯的時(shí)間優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)完成對(duì)RIF和INH耐藥性的快速檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果清晰可見[7]。但是，MTBDRplus技術(shù)在不同地區(qū)對(duì)RIF和INH耐藥檢測(cè)敏感度不同，尤其是對(duì)耐INH菌株的靈敏度差異較大[4]。

北京和上海地區(qū)已經(jīng)對(duì)MTBDRplus技術(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其對(duì)RIF和INH的敏感性分別為80.65%～98.0%和72.73%～86.5%[2-3,7]。國(guó)際上也有一些研究對(duì)MTBDRplus技術(shù)進(jìn)行臨床使用的評(píng)價(jià)。Causse[8]的研究結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)的羅氏藥敏方法相比，MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)RIF和INH的敏感度分別達(dá)100%和94.59%?？梢?，在不同國(guó)家和地區(qū)使用MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌差異較大，這可能是由于耐藥基因突變位點(diǎn)因國(guó)家和地區(qū)而異[9-10]。因此，在某個(gè)地區(qū)使用MTBDRplus技術(shù)進(jìn)行臨床檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌前很有必要進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)估。

本研究利用MTBDRplus技術(shù)快速檢測(cè)246例臨床涂陽肺結(jié)核分離株對(duì)RIF和INH的耐藥性。與傳統(tǒng)羅氏藥敏結(jié)果比較，MTBDRplus技術(shù)檢測(cè)RIF和INH的特異度均超過90%，敏感度分別為91.7%和83.3%。說明利用該技術(shù)在福州地區(qū)快速檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌有較好的適用性。

本次研究還發(fā)現(xiàn)，福州地區(qū)耐RIF結(jié)核分枝桿菌中，rpoB基因S531L位點(diǎn)突變最頻繁(58.3%)，該突變特征與福建省MDR菌株rpoB基因的突變特征報(bào)道相符[11]。而Paolo Mitto的研究表明rpoB基因突變最頻繁的是D516L(43.8%), S531L的突變率則為9.4%[12]。這種差異可能與不同地區(qū)流行菌株差異有關(guān)。本研究中，6例耐多藥MTB中，50%也存在rpoB基因S531L突變。因此在實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析時(shí)要特別注意S531L位點(diǎn)突變。

本研究顯示katG基因突變以315位點(diǎn)突變?yōu)橹鳎琲nhA基因突變以C15T位點(diǎn)突變?yōu)橹?。在所有INH突變株中，315位點(diǎn)突變率(57.7%)低于福建省MDR菌株katG基因的突變特征(73.42%)報(bào)道[11]。而inhA基因C15T位點(diǎn)突變率(42.3%)比福建省(11.39%)和北京地區(qū)(21.6%)均高出許多[11,13]。這些存在C15T位點(diǎn)突變菌株僅一株為INH耐藥菌株，與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)相比，檢測(cè)inhA耐藥基因的Kappa值僅為0.079，建議謹(jǐn)慎判斷inhA基因C15T位點(diǎn)突變引起的INH耐藥。

本試驗(yàn)結(jié)果說明福州地區(qū)INH耐藥結(jié)核菌株多與katG耐藥基因突變有關(guān)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在246株結(jié)核分枝桿菌中有3株INH耐藥株用MTBDRplus技術(shù)未檢出katG和inhA耐藥突變。說明除了katG和inhA耐藥基因外可能還有其它基因突變引起INH耐藥突變，如kasA、ahpC及oxyR基因[14]。MTBDRplus技術(shù)敏感性高，特異性強(qiáng)，但也存在一定的局限性[1]。如對(duì)檢測(cè)INH是否耐藥僅對(duì)最常見的katG和inhA2個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，而未對(duì)耐藥基因突變有關(guān)的其它基因進(jìn)行檢測(cè)，故其敏感度和特異度相較于RIF耐藥檢測(cè)偏低。另外，除突變引起耐藥外，分枝桿菌存在藥物主動(dòng)外排泵的表達(dá)，也可能與INH耐藥相關(guān)[15-16]。

福州屬于南方沿海城市，NTM引起的肺病相對(duì)內(nèi)陸地區(qū)更為嚴(yán)重，福建省NTM臨床分離率占分枝桿菌培養(yǎng)陽性株的10.2%[17]。本研究利用MTBDRplus技術(shù)區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與NTM的敏感度和特異度均為100%。因此，利用MTBDRplus技術(shù)對(duì)NTM肺病與結(jié)核病進(jìn)行篩查，對(duì)NTM肺病與結(jié)核病的鑒別診斷和治療有重要意義。

總之， MTBDRplus技術(shù)快速、靈敏度高，特異性好，能早期發(fā)現(xiàn)耐藥，尤其是耐多藥病人。對(duì)于耐藥病人而言，盡早實(shí)施個(gè)體化治療方案對(duì)于病人的規(guī)范治療和早期治愈提供保障，從公共衛(wèi)生角度而言，早期發(fā)現(xiàn)耐藥病人可有效發(fā)現(xiàn)并控制傳染源，阻斷耐藥結(jié)核病的傳播。