方秀林，杜夏，陳秋云*，高靜

（1. 江蘇大學化學化工學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2. 江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

錳是人體內(nèi)一種微量元素，也是錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、錳過氧化氫酶（Mn catalase）等多種酶的活性中心金屬離子，參與機體多種功能的維持。MnSOD和錳過氧化氫酶等錳酶結(jié)構(gòu)模擬物及其化學性能相繼被報道[1]，但錳酶模擬物在缺氧調(diào)控領(lǐng)域的運用報道較少。近年來，隨著靶向型抗腫瘤金屬藥物的發(fā)展，金屬酶模擬物及其生物活性引起人們的重視。小分子錳酶模擬物集小分子抑制劑、酶的功能模擬、線粒體功能的調(diào)控及金屬離子成像特性為一體，是一種多效應金屬藥物。許多實體瘤均存在缺氧的微環(huán)境，干預腫瘤缺氧的微環(huán)境成為腫瘤診斷與治療藥物開發(fā)的途徑之一。本文就錳酶模擬物對腫瘤缺氧信號的調(diào)控情況及納米酶-siRNA復合物協(xié)同干預腫瘤缺氧信號的研究進展作一綜述，以期為缺氧腫瘤治療藥物的研究提供參考。

1 缺氧誘導因子與腫瘤

1.1 缺氧誘導因子

缺氧是實體瘤的顯著特征，腫瘤細胞快速增殖形成大的實體瘤腫塊，導致這些腫塊周圍的血管阻塞和壓縮，異常的血管往往不能正常工作，導致向中心腫瘤區(qū)域供氧不足[1]。缺氧環(huán)境可刺激腫瘤血管的生成，目前認為缺氧誘導因子（HIF）在該過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，HIF-1的激活是這種缺氧微環(huán)境中腫瘤細胞常采用的存活途徑，目的是適應低氧壓力條件[2]?；罨腍IF-1可通過轉(zhuǎn)錄激活100多個下游基因，調(diào)節(jié)腫瘤生存和進展所需的重要生物學過程[3]，高表達的HIF也是腫瘤放化療產(chǎn)生耐藥性的一個不良預后標志物，其中涉及腫瘤細胞的葡萄糖代謝，腫瘤細胞增殖、遷移和血管生成，所以，HIF在腫瘤細胞中的激活是協(xié)調(diào)腫瘤適應缺氧環(huán)境的主要機制之一[4]。

1.2 缺氧誘導因子與腫瘤能量代謝

在快速生長的腫瘤組織中，缺氧微環(huán)境下HIF-1的高表達可促使腫瘤細胞將葡萄糖代謝從更有效的氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)榈托У奶墙徒馔緩剑员憔S持它們的能量生產(chǎn)，這就是Warburg效應[5]，故低氧環(huán)境下的腫瘤細胞傾向于消耗更多的葡萄糖以滿足其能量需求。HIF-1通過誘導參與糖酵解途徑的酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運體（GLUT）的過表達來介導這種代謝轉(zhuǎn)化，具體表現(xiàn)為腫瘤細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT1、GLUT3）和糖酵解酶[人果糖二磷酸醛縮酶A（ALDOA）]、重組人烯醇化酶1（ENO1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、己糖激酶1（HK1）、己糖激酶2（HK2）、肝臟磷酸果糖激酶（PFKL）、磷酸甘油酸激酶1（PGK1）、丙酮酸激酶M2（PKM2）和乳酸脫氫酶A（LDH-A）的高表達，可以提高糖酵解效率，并產(chǎn)生大量乳酸，形成酸性的腫瘤微環(huán)境，從而進一步促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[6]。另有研究顯示，HIF-1還可通過增加丙酮酸脫氫酶激酶1（PDK1）的表達來抑制線粒體氧化代謝[7]。因此，HIF-1的積極表達可調(diào)控腫瘤細胞的代謝重編程，以利于腫瘤細胞適應低氧應激[8]。

1.3 缺氧誘導因子與免疫調(diào)節(jié)

腫瘤的免疫逃逸是腫瘤的十大特點之一，據(jù)文獻報道這種腫瘤的惡性進展與其缺氧的微環(huán)境息息相關(guān)。缺氧可以通過改變先天性和適應性免疫細胞的功能或通過增加腫瘤細胞對免疫效應的細胞溶解活性來對抗機體的免疫應答[9]。程序性死亡受體1（PD-1）是一種重要的免疫抑制分子，其在腫瘤細胞中極為活躍，PD-1與其配體（PD-L1）的結(jié)合會啟動T細胞的程序性死亡，使腫瘤細胞獲得免疫逃逸，同時腫瘤細胞在缺氧狀態(tài)下高表達HIF及其下游通路蛋白，調(diào)節(jié)腫瘤細胞免疫應答，從而逃避免疫系統(tǒng)的識別攻擊[10]。研究表明，缺氧條件下，HIF-1與PD-L1高度共表達，且呈正相關(guān)，PD-L1是HIF-1的直接靶基因[11]。另有研究認為，由于正常細胞中HIF-1表達受HIF-1脯氨酸羥化酶（PHD）的調(diào)控，因此設計人工小分子PHD抑制腫瘤進程中的免疫逃逸或抑制腫瘤HIF的表達是腫瘤治療的新途徑[12]。

2 酶模擬物及其對缺氧信號的調(diào)控

2.1 脯氨酸羥化酶模擬物

錳作為人體必需的微量元素之一，主要分布在線粒體豐富的腦、肝、胰腺及腎組織，是過氧化氫酶等多種酶的活性中心或輔助因子，具有較好的生物化學效應。由于腫瘤細胞線粒體膜電位高于正常細胞，金屬配合物能通過線粒體膜電位誘導的被動富集作用進入腫瘤細胞的線粒體[13]。線粒體是參與錳配合物誘導腫瘤細胞凋亡的重要細胞器[14]。Miriyala等[15]和Panchatcharam等[16]報道，錳卟啉配合物（化合物1）能穿過線粒體膜進入線粒體，在線粒體內(nèi)起MnSOD酶的作用，調(diào)節(jié)線粒體氧化還原環(huán)境，誘導腫瘤細胞的凋亡。HIF-1α能被PHD降解，其中PHD屬于活性中心為二價鐵離子的非血紅素氧化酶。陳秋云研究團隊用錳替代PHD結(jié)構(gòu)活性中心二價鐵（化合物2），制備了其結(jié)構(gòu)模擬物（化合物3），結(jié)果表明化合物3能與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合進入轉(zhuǎn)鐵蛋白高表達的腫瘤細胞[17-18]。腫瘤細胞中的轉(zhuǎn)鐵蛋白高于正常細胞，因此錳配合物對于腫瘤細胞具有較好的識別能力，除了減弱腫瘤細胞的線粒體的功能外，還具有活性氧（reactive oxygen species，ROS）信號傳導的自噬細胞死亡的功能[19]；當ROS被清除時，抑制劑誘導的自噬受到阻礙[20]。另外，線粒體中過量產(chǎn)生的ROS可以誘導細胞凋亡和自噬蛋白質(zhì)的釋放[21]。Pialoux等[22]報道一定量ROS負責穩(wěn)定HIF-1α，而低劑量的外源性H2O2可上調(diào)HIF-1α的表達。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)化合物3和三氮環(huán)十二烷配體的過氧化氫酶模擬物（化合物4）進行短期預處理能阻止H2O2誘導的神經(jīng)細胞凋亡。此外，Kaewpila等[24]的研究結(jié)果顯示：錳超氧化物歧化酶能抑制低氧誘導的HIF-1α、干預抗凋亡蛋白（Bcl-2）和神經(jīng)保護性HIF-1α下游基因[血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和促紅細胞生成素（EPO）]的表達。上述文獻報道的結(jié)果說明用小分子錳酶模擬物干預HIF-1α，可觸發(fā)線腫瘤細胞粒體無氧糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸姿峄瘉碚{(diào)節(jié)能量代謝，這為靶向癌癥代謝開啟了一個治療窗口。

2.2 錳酶模擬物對腫瘤代謝的調(diào)控

腫瘤細胞在氧氣充足的情況下仍然選擇糖酵解的代謝方式為瘤體供能，即有氧糖酵解[25]。腫瘤有氧糖酵解可導致丙酮酸進入線粒體，致三羧酸循環(huán)代謝被抑制，同時，LDH-A表達增多，從而促進丙酮酸進入糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為乳酸，導致一個酸性的微環(huán)境出現(xiàn)而使腫瘤細胞更具有侵襲性[26-27]。LDH-A是HIF-1α調(diào)控并影響腫瘤糖酵解途徑中高度活化的酶[28]。陳秋云研究團隊將具有乳酸脫氫酶識別基團（吡咯甲酮基）與二吡啶甲基胺錳配合物共價偶聯(lián)制備成錳配合物（化合物5），其具有調(diào)節(jié)腫瘤細胞線粒體膜電位與線粒體鈣吸收等特性，還可以抑制LDH-A的表達，從而減少乳酸的生成，降低HepG-2細胞中HIF-1α和GLUT1的表達，減弱腫瘤細胞的有氧糖酵解[29]。另外，線粒體代謝中脂肪酸合酶（FASN）是脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶，負責將丙二酸單酰輔酶A和乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變成脂肪酸。與正常細胞外源性攝取脂肪酸相比，腫瘤細胞偏好于依賴FASN從頭合成脂肪酸，F(xiàn)ASN成為開發(fā)調(diào)節(jié)腫瘤能量藥物的靶點之一[30]。有機小分子脂肪酸合成酶抑制劑已有較多報道[31]，金屬藥物用于脂肪酶抑制報道較少。Wang等[32]研究了化合物5與FASN的結(jié)合作用及其對乳腺癌細胞中的FASN表達量的影響，結(jié)果表明化合物5可以與FASN結(jié)合，降低乳腺癌細胞中FASN的表達量，調(diào)節(jié)糖酵解和脂肪酸代謝的交互機制，從而影響乳腺癌細胞的生長。綜上所述，錳配合物可通過抑制乳酸的生成來調(diào)節(jié)氧化磷酸化與糖酵解之間的平衡，從而改變腫瘤微環(huán)境，通過干擾脂肪酸的合成來調(diào)控腫瘤細胞線粒體代謝。

3 納米錳缺氧抑制劑

為提高腫瘤細胞對金屬模擬酶的吸收，近年來，納米酶模擬物成為研究的熱點。Attar等[33]報道了金屬納米模擬酶及其在生物醫(yī)學方面運用的研究進展。腫瘤細胞中過氧化氫的濃度高于正常細胞，過氧化氫響應的抗腫瘤化合物具有腫瘤細胞內(nèi)過氧化氫激活的抗腫瘤效應，可提高對腫瘤的抑制作用，并且減少對其他非靶向部位的毒副作用，降低抗腫瘤配合物的副作用，腫瘤靶向RGD肽（精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸）修飾納米過氧化氫酶模擬物可提高納米酶模擬物在腫瘤細胞的吸收[34]。近期，胍胺修飾的納米硅酸錳被用于缺氧腫瘤細胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）及過氧化物酶4的抑制，從而通過ROS及GSH途徑誘導腫瘤細胞鐵死亡（ferroptosis）[35]。由于氧化錳為酸響應的Mn2+釋放體，因此，以氧化錳為外殼、磁性碳化鐵為核包裹葡萄糖氧化酶（GOD）可作為Mn2+、O2和GOD的輸送體，從而調(diào)節(jié)腫瘤的微環(huán)境[36]。Musetti等[37]發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白納米籠（ferritin nanocages，F(xiàn)Tns）能富集在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）高表達的缺氧腫瘤細胞，也能作用于T-細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-2（TIM-2），抑制HIF-1α的表達，通過HIF-1α及ROS等發(fā)揮的多種效應實現(xiàn)對腫瘤的抑制作用。另有研究顯示，近紅外光激活的納米錳復合物可利用光和水產(chǎn)生單線態(tài)氧，彌補腫瘤缺氧環(huán)境中光動力學治療（PDT）試劑不能有效產(chǎn)生單線態(tài)氧的缺陷，這類光活性錳復合物是光響應及過氧化氫激活的納米HIF-1α抑制劑[38]。為提高金屬配合物靶向性，降低其非特異性吸收，在牛血清白蛋白（BSA）包裹的錳配合物的外殼上通過共價鍵修飾引入腫瘤細胞高表達的GLUT-1核酸適配體，可以提高納米顆粒對腫瘤的識別，因而GLUT-1與BSA修飾的納米錳配合物具有腫瘤靶向性吸收、光驅(qū)動釋放氧與熱量的功能，該納米顆粒能抑制GLUT-1與HIF-1α的表達，通過線粒體途徑干擾腫瘤的能量代謝，實現(xiàn)腫瘤的抑制效應[39]。此外，以PtCo作為氧化酶模擬物、MnO2為過氧化氫酶模擬物能獲得缺氧響應的納米金屬藥物MnO2@PtCo，其不僅能緩解缺氧，還可通過ROS途徑抑制腫瘤的生長[40]。最近，有研究認為可提高細胞內(nèi)氧壓或運用修飾的MnO2納米酶緩解缺氧并作為ROS產(chǎn)生源，從而誘導腫瘤細胞凋亡[41-42]。然而，目前納米氧化酶的體內(nèi)毒性與生物效應有待進一步研究。

4 納米磁性RNA輸送體

長期以來通過化學試劑誘導細胞凋亡，從而引起HIF-1α的下調(diào)，利用基因干預HIF-1α是近年來研究的熱點之一。HIF-1α主要存在于細胞核中，通過干預存在線粒體中的少量HIF-1α來探索腫瘤的能量代謝調(diào)控是該研究的新途徑。由于DNA分子上磷酸基團及堿基上N、O與金屬離子具有較強的結(jié)合能力，因此金屬DNA納米球可用于神經(jīng)生長因子siRNA的輸送，干預胰腺癌的生長[43]。陳秋云研究團隊運用富含鳥嘌呤-腺嘌呤-鳥嘌呤（GAG）堿基序列的核酸與Fe（Ⅱ）、Mn（Ⅱ）配位組裝制備了線粒體靶向siRNA輸送體，該輸送體能通過電荷作用與堿基配對雙效作用負載siRNA到線粒體，干擾HIF-1α的表達，實現(xiàn)了缺氧乳腺癌的基因治療[44]。由于HIF-1α能夠被miRNA調(diào)節(jié)，Yang等[45]通過miRNA對HIF-1α表達的抑制來控制腫瘤的生長，這也是腫瘤缺氧基因治療的有效途徑。綜上所述，金屬配位誘導組裝制備的納米金屬核酸具有藥物輸送、基因輸送及生物相溶性好等特點，是具有良好發(fā)展前景的多效應缺氧調(diào)控納米藥物。

5 結(jié)論與展望

目前，有關(guān)氧化酶模擬性能的錳配合物及納米氧化酶模擬物的結(jié)構(gòu)與性能已進行了深入的研究[46-47]，錳酶模擬物具有多模態(tài)成像、線粒體途徑調(diào)節(jié)腫瘤缺氧信號的功能，尤其是納米有機金屬錳藥物有望借助多模分子影像技術(shù)用于磁共振成像（MRI）影像監(jiān)測治療。錳配合物及納米復合物在細胞及動物水平實現(xiàn)了對缺氧腫瘤的調(diào)控，但化合物的作用機制尚未闡明。根據(jù)缺氧腫瘤生物標志物，設計生物分子激活的納米酶是開發(fā)低毒性納米藥物的有效途徑，此外，集化學治療與基因輸送為一體的錳酶模擬物是具有良好發(fā)展前景的多效應缺氧調(diào)控納米藥物。