趙梅珍

【摘要】 目的 研究玉屏風(fēng)口服液對(duì)變應(yīng)性鼻炎（AR）小鼠鼻腔炎癥及水通道蛋白5（AQP5）表達(dá)的影響。方法 30只雌性BALB/c小鼠， 隨機(jī)分為對(duì)照組、鼻炎組和玉屏風(fēng)口服液組， 各10只。除對(duì)照組外， 其他兩組腹腔注射卵清蛋白（OVA）與氫氧化鋁[Al（OH）3]配制的致敏液及OVA滴鼻建立AR小鼠模型。對(duì)照組、鼻炎組生理鹽水0.2 ml灌胃， 玉屏風(fēng)口服液組玉屏風(fēng)口服液2.0 ml/kg灌胃， 35 d后， 比較三組癥狀評(píng)分、血清卵清蛋白特異性IgE（OVA sIgE）和白細(xì)胞介素4（IL-4）含量、鼻黏膜病理學(xué)改變、AQP5 mRNA和蛋白含量。結(jié)果 鼻炎組行為學(xué)積分為（7.3±0.5）分， 對(duì)照組行為學(xué)積分為（1.8±0.3）分， 玉屏風(fēng)口服液組行為學(xué)積分為（2.0±0.2）分。對(duì)照組和玉屏風(fēng)口服液組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;兩組積分均顯著低于鼻炎組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。鼻炎組、對(duì)照組和玉屏風(fēng)口服液組血清OVA sIgE含量分別為（1.81±0.32）、（0.25±0.14）、（0.28±0.10）μg/μl。鼻炎組、對(duì)照組和玉屏風(fēng)口服液組IL-4含量分別為（20.10±2.30）、（6.50±1.30）、（6.70±1.50）pg/ml。對(duì)照組與玉屏風(fēng)口服液組的血清OVA sIgE含量及IL-4含量比較， 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;鼻炎組的血清OVA sIgE含量及IL-4含量均高于對(duì)照組與玉屏風(fēng)口服液組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。鼻黏膜AQP5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量用β-actin校正， 對(duì)照組表達(dá)量設(shè)為1， 玉屏風(fēng)口服液組和鼻炎組分別為對(duì)照組的3倍和173倍。玉屏風(fēng)口服液組和對(duì)照組比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;鼻炎組顯著高于玉屏風(fēng)口服液組和對(duì)照組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。對(duì)照組、玉屏風(fēng)口服液組和鼻炎組AQP5蛋白含量分別為（0.17±0.03）、（0.18±0.01）、（0.53±0.02）ng/ml。玉屏風(fēng)口服液組和對(duì)照組比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;鼻炎組顯著高于玉屏風(fēng)口服液組和對(duì)照組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 玉屏風(fēng)口服液可減輕AR小鼠鼻黏膜炎癥， 降低細(xì)胞因子分泌和AQP5表達(dá)， 減輕鼻黏膜細(xì)胞的受損程度， 對(duì)AR小鼠鼻黏膜有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 玉屏風(fēng)口服液;變應(yīng)性鼻炎;水通道蛋白5

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.18.112

變應(yīng)性鼻炎（allergicrhinitis， AR）指接觸變應(yīng)原后， 免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的介質(zhì)釋放， 多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等參與的鼻黏膜非感染性炎性疾病。其發(fā)病率高達(dá)10%～40%且逐年上升， 嚴(yán)重影響患者生活和工作， 給社會(huì)、家庭帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確。玉屏風(fēng)口服液的主要成分為黃芪、防風(fēng)、白術(shù)（炒）， 黃芪和白術(shù)均能抗炎及提高機(jī)體免疫力[2]， 其抑制IgE產(chǎn)生和抗炎性介質(zhì)及中和變應(yīng)原， 其抗過敏作用確切[3]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察其對(duì)水通道蛋白5 （aquaporin5， AQP5）表達(dá)水平的影響， 研究AR發(fā)病機(jī)制， 探討其對(duì)AR的治療作用。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購BALB/c小鼠30只， 雌性， SPF級(jí)， 6～8周齡， 20 g/只。飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分為對(duì)照組、鼻炎組和玉屏風(fēng)口服液組， 每組10只。

1. 2 試劑 OVA（A5503， Sigma）， 玉屏風(fēng)口服液（湖北東信藥業(yè)有限公司）， Mouse OVA-sIgE ELISA Kit （武漢華美）， Mouse IL-4 Quantikine ELISA Kit（R&D）， Anti-Aquaporin 5 antibody（AB78486， Abcam）， PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（6210A， takara）， SYBR Premix Ex TaqⅡ（RR820A， takara）， 細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（P0027， 碧云天）。

1. 3 致敏、激發(fā)和給藥 20 μg OVA與2 mg Al（OH）3溶于100 μl生理鹽水， 鼻炎組1、7、14、21 d腹腔注射， 對(duì)照組采用生理鹽水;鼻炎組和玉屏風(fēng)口服液組小鼠兩側(cè)鼻腔各滴10 μl 10%OVA， 28～35 d， 對(duì)照組采用生理鹽水;對(duì)照組、鼻炎組采用生理鹽水0.2 ml灌胃， 玉屏風(fēng)口服液組采用玉屏風(fēng)口服液2.0 ml/kg灌胃， 均從致敏第1天開始， 致敏前1 h給藥， 35 d。

1. 4 項(xiàng)目觀察和檢測(cè)方法

1. 4. 1 癥狀學(xué)觀察 最后一次滴鼻24 h內(nèi)， 三組用OVA各滴鼻1次， 觀察每只小鼠30 min， 記錄其噴嚏、搔鼻和鼻涕量。噴嚏1～3次/輕擦鼻數(shù)次/少量鼻涕各1分， 噴嚏4～10次/

摩擦兩鼻孔間/鼻涕較前增加各2分， 噴嚏>11次/摩擦鼻周四處/涕流滿面各3分?？偡?5分示造模成功。

1. 4. 2 血清OVA sIgE和IL-4含量 最后一次滴鼻24 h后， 摘眼球取血， 3000 r/min， 收集血清。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清OVA sIgE和IL-4含量， 酶標(biāo)儀（品牌：Melecullar Devices， 型號(hào)：PARADIGM）檢測(cè)采集數(shù)據(jù)。

1. 4. 3 鼻黏膜病理學(xué)改變 最后一次滴鼻24 h后斷頸處死小鼠， 取鼻中隔黏膜， HE染色， 用熒光倒置相差顯微鏡觀察中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等浸潤情況。

1. 4. 4 檢測(cè)AQP5 mRNA含量 常規(guī)Trizol法提取總RNA。據(jù)PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列：AQP5 正向：5-GGC CAC ATC AAT CCG GCC ATT A-3， 反向：5-GGC TGT TCC ATG AAC CCA GCC-3;β-actin 正向：5-TGC TGT CCC TGT ATG CCT CT-3， 反向：5-TTG ATG TCA CGC ACG ATT TC-3。

據(jù)SYBR Premix Ex TaqⅡ說明書， 用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國ABI， 7500Fast）擴(kuò)增。

1. 4. 5 Western blot檢測(cè)AQP5蛋白含量 試劑盒提取鼻黏膜AQP5蛋白， 常規(guī)WB進(jìn)行SDS-PAGE電泳， 凝膠成像分析系統(tǒng)和IPP6.0圖像分析軟件拍照和分析條帶灰度值。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 癥狀評(píng)分 鼻炎組：行為學(xué)積分（7.3±0.5）分， 模型成功。對(duì)照組和玉屏風(fēng)口服液組：行為學(xué)積分分別為（1.8±0.3）分和（2.0±0.2）分， 模型未成功， 兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;兩組積分均顯著低于鼻炎組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。

2. 2 血清OVA sIgE和IL-4含量 鼻炎組、對(duì)照組和玉屏風(fēng)口服液組血清OVA sIgE含量分別為（1.81±0.32）、（0.25±0.14）、（0.28±0.10）μg/μl。鼻炎組、對(duì)照組和玉屏風(fēng)口服液組IL-4含量分別為（20.10±2.30）、（6.50±1.30）、（6.70±1.50）pg/ml。對(duì)照組與玉屏風(fēng)口服液組的血清OVA sIgE含量及IL-4含量比較， 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;鼻炎組的血清OVA sIgE含量及IL-4含量均高于對(duì)照組與玉屏風(fēng)口服液組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。

2. 3 鼻黏膜病理學(xué)改變 鼻炎組鼻黏膜不完整， 組織間質(zhì)水腫明顯， 小血管擴(kuò)張， 大量嗜酸性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤;對(duì)照組與玉屏風(fēng)口服液組均鼻黏膜上皮完好， 組織間隙無明顯水腫、血管未見擴(kuò)張， 僅見少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤。

2. 4 鼻黏膜AQP5 mRNA含量 鼻黏膜AQP5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量用β-actin校正， 對(duì)照組表達(dá)量設(shè)為1， 玉屏風(fēng)口服液組和鼻炎組分別為對(duì)照組的3倍和173倍。玉屏風(fēng)口服液組和對(duì)照組比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;鼻炎組顯著高于玉屏風(fēng)口服液組和對(duì)照組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。

2. 5 Western blot檢測(cè)AQP5蛋白含量 對(duì)照組、玉屏風(fēng)口服液組和鼻炎組AQP5蛋白含量分別為（0.17±0.03）、（0.18±0.01）、（0.53±0.02）ng/ml。玉屏風(fēng)口服液組和對(duì)照組比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;鼻炎組顯著高于玉屏風(fēng)口服液組和對(duì)照組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。

3 討論

隨著社會(huì)工業(yè)化發(fā)展， AR發(fā)病率逐年增高， 嚴(yán)重影響患者生活、健康和工作[4]。流涕過多是AR的主要癥狀之一， 如何有效改善及研究其機(jī)制是關(guān)注的重點(diǎn)。AQP5在維持鼻腔液體平衡中的作用最重要， 主要分布在小鼠鼻黏膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[5]。中醫(yī)將AR歸為“鼻鼽”病[6]， 主要是肺陽不足且風(fēng)邪入侵致肺氣受阻[7]。黃芪益氣固表、實(shí)衛(wèi)止汗;白術(shù)健脾益氣;防風(fēng)祛風(fēng)解表。玉屏風(fēng)口服液可固表止汗、補(bǔ)氣虛、固表虛、增強(qiáng)人體抵抗外邪的能力且具有抗炎的藥理作用。

本研究結(jié)果表明， 玉屏風(fēng)口服液顯著降低血清OVA sIgE和IL-4含量及小鼠鼻黏膜AQP5表達(dá)， 減輕組織間質(zhì)水腫、小血管擴(kuò)張及炎癥細(xì)胞的浸潤。

綜上所述， 玉屏風(fēng)口服液可改善流涕等癥狀， 有效改善通氣功能及炎性因子反應(yīng)， 為改善AR提供理論依據(jù)。

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[收稿日期：2019-04-02]