(中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院， 山西 太原 030051)

樹莓(RubusidaeusL.)，薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)空心莓亞屬植物，又名覆盆子、懸鉤子、木莓、山莓等[1]。樹莓果實(shí)肉嫩、多汁，風(fēng)味獨(dú)特，除富含氨基酸、維生素、糖類、礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分之外，還含有豐富的花青素、單寧、鞣花酸、黃酮[2]等功能性成分，被譽(yù)為藥食同源的“第三代水果”[3]。但樹莓極易變質(zhì)腐爛，不利于運(yùn)輸保存，且樹莓果實(shí)糖分含量低，口感偏酸，因此除了少量用于鮮食以外，還可初步加工為果汁[4]、果凍[5]、果醬和果酒[6]等食品，或者將樹莓提取物作為保健品和化妝品主材或輔料。在加工過(guò)程中，殘?jiān)械臉漭淹ǔＷ鳛閺U料，尚未得到有效的開發(fā)利用。樹莓籽油中含有亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸，含量高達(dá)85.97%[7]，與紅花籽油(87.10%)[9]和葡萄籽油(86.84%)[10]中不飽和脂肪酸含量相似。除了脂肪酸，樹莓籽油中還含有原花青素和維生素E等多種活性成分，且維生素E含量較高，是紅花籽油和葡萄籽油的近6倍[11-12]。除此之外，樹莓種子還具有抗血栓[13]、降血脂[14]和抗癌[15]等醫(yī)療保健功能。

樹莓的揮發(fā)性油中含有芳香烴、醛、酮、酯、單萜等物質(zhì)[16]，存在豐富的三萜類化合物和皂甙。Kimura等發(fā)現(xiàn)，茶皂甙可以通過(guò)抑制胰脂肪酶活性，實(shí)現(xiàn)高脂飲食小鼠的抗肥胖作用[17]。Ge等研究發(fā)現(xiàn)，茅莓總皂甙可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株K 562凋亡[18]；但目前對(duì)樹莓總皂甙的研究尚不完善。

目前植物油的提取方法主要是機(jī)械壓榨法、水蒸氣蒸餾法和有機(jī)溶劑萃取法，有機(jī)溶劑萃取法又包括索氏提取(SE)、超聲波輔助提取(UAE)和超臨界CO2法萃取等[19]。鑒于樹莓籽含量較少(干重占樹莓鮮果的9%～12%[20])，且含油量不高等特點(diǎn)，選擇超聲輔助乙醇提取法(Ultrasonic-assisted extraction-ethanol，UAE-Et)、超聲輔助石油醚提取法(Ultrasonic-assisted extraction-petrol ether，UAE-PE)和索氏石油醚提取法(Soxhlet extraction-石油醚，SE-PE)，研究3種不同提取方式對(duì)紅樹莓籽油成分的影響，比較紅樹莓籽油的提取率、油脂成分、抗氧化活性和總皂甙含量的差異，為不同用途的樹莓籽油找到最合適的提取方式，為紅樹莓籽油的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紅樹莓來(lái)味里(RubusidaeusL.var.Reveille)冷凍鮮果，于-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑及藥品

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH；色譜級(jí))和齊墩果酸(色譜級(jí))：上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鉀、甲醇、氯化鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇、石油醚(60～90 ℃)、高氯酸(70%～72%)、香蘭素、冰乙酸和乙酸乙酯均為分析純。

1.3 主要儀器

CLF-30 B高速連續(xù)型超微粉碎機(jī)：浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠；HH-8恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；KQ-250 DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SOX 406索氏提取儀：濟(jì)南舜騰生物儀器有限公司；RE-2000 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JH-14-04可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；DNM-960 G酶標(biāo)分析儀：北京普朗新技術(shù)有限公司；Trace 1300-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 紅樹莓籽油的提取

將室溫解凍的紅樹莓果實(shí)榨汁勻漿，通過(guò)20目篩(0.85 mm)篩分得到紅樹莓籽。流水沖洗至種子完整干凈，在60 ℃下干燥至恒重。用研磨機(jī)打粉備用。

UAE-Et參考Teng等[21]的最佳工藝：稱取樹莓籽粉5 g，置于三角錐形瓶中，加入無(wú)水乙醇，提取樹莓籽油。提取條件：料液比1∶30，超聲功率250 W，提取時(shí)間30 min，溫度50 ℃，重復(fù)提取2次。抽濾后合并樹莓籽油的提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于35 ℃除去溶劑。

UAE-PE參考張佰清等[22]的最佳工藝：稱取樹莓籽5 g，置于三角錐形瓶中，加入石油醚，提取樹莓籽油。提取條件：料液比1∶11，超聲功率100 W，提取時(shí)間25 min，溫度30 ℃，重復(fù)提取2次。抽濾后合并樹莓籽油的提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于35 ℃除去溶劑。

SE-PE參考Teng等[21]的最佳工藝：稱取樹莓籽5 g，脫脂濾紙包裹置于濾紙架上，再用紗布包裹。量取50 mL石油醚倒入抽提杯，打開抽提儀開始提取。先浸提再抽提。提取條件：料液比為1∶10，溫度80 ℃，提取時(shí)間180 min。提取完成，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于35 ℃除去溶劑。

所有油液經(jīng)4 000 r·min-1離心10 min取上層清液。計(jì)算提取得率公式如下：

(1)

2.2 紅樹莓籽油脂肪酸含量測(cè)定

參考楊靜等[23]的方法，將樣品甲酯化，待作GC-MS分析。

GC條件：HP-5 MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；升溫程序：初始溫度為100 ℃，保持5 min，然后以10 ℃·min-1升至250 ℃，保持10 min；進(jìn)樣量為0.2μL；載氣(高純氦氣)流量為1.5mL·min-1，分流比為20∶1；溶劑延遲3 min。

表1 3種提取方式紅樹莓籽油的脂肪酸組成和相對(duì)含量

序號(hào)Rt/min化合物名稱 分子式 分子量相對(duì)含量/%UAE-EtUAE-PESE-PE17.053-乙基己烷C8H181140.110.040.1227.282,2-二甲基己酮C8H16O1280.20.14—37.872-乙基己醇C8H18O1300.150.1—47.97γ-松油烯C10H161360.14——58.01芳樟醇C10H18O1540.16——68.21十三烷C13H281840.10.060.08710.51十四烷C14H301980.110.10.14810.86正十五烷C15H322120.180.150.3911.62月桂酸甲酯C13H26O22140.080.020.11011.692,4-二叔丁基酚C14H22O2060.220.03—1113.142-甲基十五烷C16H342260.140.130.081213.51正十六烷C16H342260.180.210.21314.05十三酸甲酯C14H28O22280.250.220.211414.71正十八烷C18H382540.110.160.081515.72正二十烷C20H422820.130.180.091615.95蓖麻油酸C18H34O32980.20.210.251716.13棕櫚酸甲酯C17H34O22703.072.943.191816.89十二烷二酸二甲酯C14H26O42580.130.170.141917.82亞油酸甲酯C19H32O229257.4559.1260.822017.90亞麻酸甲酯C19H33O229324.7826.0427.42118.00硬脂酸甲酯C19H38O22980.861.340.732219.42正二十一烷C21H442960.110.110.082319.50(Z)-油酸甲酯C19H36O22960.280.30.362419.68花生酸甲酯C21H42O23260.580.590.662520.50單棕櫚酸甘油C19H38O43300.160.110.182621.16二十二烷C22H463100.110.090.12721.46十七烷酸甲酯C18H36O22840.290.230.392823.28正二十四烷C24H503380.28—0.32924.03二乙二醇單硬脂酸酯C22H44O43720.080.110.133024.87木焦油酸甲酯C25H50O2382——0.033125.40麥角甾醇C28H44O3960.11——3226.88二十八烷C28H583940.240.220.26總計(jì)91.9993.1296.42ω-6/ω-32.322.272.22

注：“—”低于檢出限。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度230 ℃；進(jìn)樣口溫度200 ℃；倍增器電壓1 376 V，電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6μA，接口溫度280 ℃。掃描范圍為20～500 amu。

2.3 紅樹莓籽油DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考Musa等[24]的方法，并作適當(dāng)修改。將不同提取方式紅樹莓籽油用無(wú)水乙醇配制成不同濃度梯度的溶液。取50μL不同濃度的樣品溶液與250μL 0.2 mmol·mL-1的DPPH乙醇溶液在96孔板中混勻，于室溫避光靜置40 min后在517 nm處測(cè)定吸光度A樣品。采用相同方法測(cè)定50μL無(wú)水乙醇溶液和250μL DPPH溶液混勻后的吸光度A空白，以及50μL樣品溶液和250μL無(wú)水乙醇溶液混合后的吸光度A對(duì)照。

DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對(duì)照]×100%

(2)

并根據(jù)清除率計(jì)算樣品的IC50(半抑制濃度，即清除率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品濃度)。

2.4 紅樹莓籽油中總皂甙含量的測(cè)定

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

參照康琴等[25]的方法，并作適當(dāng)修改。用分析天平精確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制成0.18 mg·mL-1的甲醇標(biāo)準(zhǔn)液，分別量取不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)液于具塞玻璃試管中，60 ℃水浴吹干，各加入0.2 mL 5%香蘭素-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，振蕩后于60 ℃水浴中加熱15 min后取出，流水冷卻中止反應(yīng)，各加入5 mL乙酸乙酯，振蕩搖勻，甲醇作空白，反應(yīng)30 min后于547 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以樣品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=5.021 8X+0.085 5，r2=0.999，在0～150μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.4.2樣品中總皂甙含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取(40±1)mg的不同樣品，用甲醇溶解在25 mL容量瓶中定容。取0.1 mL于具塞玻璃試管中，60 ℃水浴揮干，揮干后按上述步驟進(jìn)行測(cè)定。

2.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

3 結(jié)果與討論

3.1 3種提取方式紅樹莓籽油提取率

3種提取方式紅樹莓籽油的提取率如圖1所示。由圖1可知，UAE-Et紅樹莓籽油的提取率最高，為18.55%，UAE-PE提取率為10.18%，SE-PE提取率為13.58%。根據(jù)文獻(xiàn)中的最佳工藝，UAE-Et、UAE-PE和SE-PE的提取率分別為23.06%、12.97%和15.02%[21-22]。不同提取方式的提取率與文獻(xiàn)結(jié)果相似，略低，且趨勢(shì)相同，均為UAE-Et>SE-PE>UAE-PE。由此可見，不同提取方法的提取率差異較大，這與Péres等[26]的研究結(jié)果一致。因此，超聲輔助提取的操作簡(jiǎn)單，提取效率更高，更適合紅樹莓籽油的提取，且在超聲輔助提取的條件下，乙醇作為溶劑效果更好，且毒副作用較小。

圖2 UAE-Et紅樹莓籽油的總離子流圖

注：利用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，多重比較方法為Duncan(α=0.05)法，不同字母表示差異顯著(p<0.05)。圖1 3種提取方式紅樹莓籽油提取率

3.2 紅樹莓籽油脂肪酸

UAE-Et紅樹莓籽油的總離子流圖如圖2所示。采用峰面積歸一化法得出各組分的相對(duì)含量，各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖檢索采用NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行檢索，并逐個(gè)解析各峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖，定性定量結(jié)果見表1。由表1可知，不同提取方式紅樹莓籽油中共鑒定出32種物質(zhì)，占物質(zhì)總量的91.99%～96.42%。UAE-Et鑒定物質(zhì)種類最多，共31種，其中包括4種不飽和脂肪酸，占物質(zhì)總量的82.71%：亞油酸(57.45%)、亞麻酸(24.78%)、油酸(0.28%)、蓖麻油酸(0.2%)；7種飽和脂肪酸，占物質(zhì)總量的5.26%：棕櫚酸(3.07%)、硬脂酸(0.86%)和花生酸(0.58%)等；21種其它物質(zhì)：正二十四烷(0.28%)、正十五烷(0.18%)、二十八烷(0.24%)等烷烴類以及芳樟醇(0.16%)等醇類和γ-松油烯(0.14%)等萜烯類物質(zhì)。UAE-Et紅樹莓籽油中不飽和脂肪酸含量最少，但含有物質(zhì)種類最多，且含有萜烯類、酮類、醇類等物質(zhì)。Teng等[25]采用超聲輔助法得到的紅樹莓籽油成分與該結(jié)果差異較大，不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%，且不含烷烴類、醇類和萜烯類等物質(zhì)，這可能與原料產(chǎn)地、品種等差異有關(guān)。

UAE-PE共鑒定出27種物質(zhì)，其中包括4種不飽和脂肪酸(占物質(zhì)總量的85.76%)：亞油酸(59.12%)、亞麻酸(26.04%)、油酸(0.3%)、蓖麻油酸(0.21%)；7種飽和脂肪酸(占物質(zhì)總量的5.51%)：棕櫚酸(2.94%)、硬脂酸(1.34%)、花生酸(0.59%)；16種其它物質(zhì)：二十八烷(0.22%)、正十六烷(0.21%)、正二十烷(0.18%)等烷烴類以及2-乙基己醇(0.1%)等醇類和2,2-二甲基己酮(0.14%)等酮類物質(zhì)。SE-PE紅樹莓籽油中共鑒定出26種物質(zhì)，其中包括4種不飽和脂肪酸(占物質(zhì)總量的88.83%)：亞油酸(60.82%)、亞麻酸(27.40%)、油酸(0.36%)、蓖麻油酸(0.25%)；8種飽和脂肪酸(占物質(zhì)總量的5.45%)：棕櫚酸(3.19%)、硬脂酸(0.73%)、花生酸(0.66%)；14種其它物質(zhì)：正二十四烷(0.30%)、正十五烷(0.30%)、二十八烷(0.26%)等烷烴類物質(zhì)。3種提取方法得到的紅樹莓籽油中物質(zhì)種類有差異，這可能是超聲輔助提取法和索氏提取均利用“相似相溶”的原理[27]，不同溶劑的產(chǎn)物略有差異，且索氏提取法溫度較高，可能對(duì)小分子的物質(zhì)結(jié)構(gòu)有破壞[28]。

多個(gè)機(jī)構(gòu)對(duì)膳食中ω-6/ω-3脂肪酸的均衡比例提出了建議：聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織建議5∶1～10∶1[29]，中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的ω-6/ω-3脂肪酸比例為4∶1～6∶1[30]。研究表明，降低ω-6/ω-3脂肪酸比例有助于降低患癌癥[31]和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[32]。但是，Simopoulos等[33]研究指出，目前人類日常飲食中ω-6/ω-3脂肪酸比例過(guò)高并呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，2000年為10∶1～20∶1，2003年為10∶1～30∶1。UAE-Et、UAE-PE和SE-PE紅樹莓籽油的ω-6/ω-3脂肪酸比例為2.22∶1～2.32∶1(見表1)，明顯低于生活中常用大豆油(8.62∶1)和花生油(25.34∶1)[8]，對(duì)改善ω-6/ω-3脂肪酸比例更有效。因此，紅樹莓籽油有助于改善我國(guó)居民膳食中過(guò)高的ω-6/ω-3脂肪酸比例，調(diào)整ω-6/ω-3脂肪酸比例在合適的范圍內(nèi)[34]。

3.3 3種提取方式紅樹莓籽油DPPH自由基清除率

由圖3可見，3種提取方式得到的紅樹莓籽油對(duì)DPPH自由基均有清除作用。根據(jù)清除率曲線，計(jì)算出不同提取方式紅樹莓籽油的DPPH自由基IC50分別為：IC50 UAE-PE(27.43 mg·mL-1)>IC50 SE-PE(5.89 mg·mL-1)>IC50 UAE-Et(4.36 mg·mL-1)。由此可得，不同提取方式紅樹莓籽油對(duì)DPPH自由基清除作用的大小為：UAE-Et>SE-PE>UAE-PE。Asensio等研究發(fā)現(xiàn)，氧化單萜與酚類協(xié)同比單獨(dú)的酚類有更強(qiáng)的抗氧化性[35]，表明酚類可能與氧化單帖有協(xié)同作用。UAE-Et紅樹莓籽油中含有較多的烯萜類物質(zhì)，如γ-松油烯、芳樟芳樟醇、麥角甾醇等，因此，含有烯萜類物質(zhì)的紅樹莓籽油具有更高的抗氧化活性。

圖3 3種提取方式紅樹莓籽油的IC50值

3.4 3種提取方式紅樹莓籽油中的總皂甙含量

3種提取方式紅樹莓籽油中總皂甙含量如圖4所示。由圖4可見，3種提取方式紅樹莓籽油中總皂甙含量分別為：UAE-Et(351.88 mg·g-1)>UAE-PE(267.66 mg·g-1)>SE-PE(178.45 mg·g-1)。UAE-Et、UAE-PE和SE-PE 3種提取方式紅樹莓籽油的提取率分別為18.55%、10.18%和13.58%，因此紅樹莓籽中的總皂甙含量分別為：65.27 mg·g-1、27.25 mg·g-1和24.23 mg·g-1。趙偉偉測(cè)量了樹莓根、莖、葉片和側(cè)枝中的總皂甙含量，在10～15 mg·g-1之間，各不同器官總皂甙的平均含量為11.3 mg·g-1，紅樹莓籽中的總皂甙含量均高于這一值[36]。該結(jié)果與3.2項(xiàng)中GC-MS鑒定結(jié)果一致，進(jìn)一步證明UAE-Et紅樹莓籽油中萜烯類物質(zhì)含量更高，抗氧化活性更強(qiáng)。

圖4 3種提取方式紅樹莓籽油總皂甙含量

4 結(jié) 論

采用3種不同的提取方法提取紅樹莓籽油，通過(guò)GC-MS鑒定分析比較不同提取方式紅樹莓籽油的脂肪酸組成，并通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)測(cè)定其體外抗氧化活性，最后測(cè)定其總皂甙含量。結(jié)果表明，UAE-Et紅樹莓籽油提取率更高，為18.55%，所含物質(zhì)種類最多為31種，體外抗氧化活性更強(qiáng)，IC50值為4.36 mg·mL-1，且總皂甙含量更高，為351.88 mg·g-1。但其不飽和脂肪酸含量為82.71%，小于UAE-PE(85.76%)和SE-PE(88.83%)。同時(shí)，UAE-Et、UAE-PE和SE-PE紅樹莓籽油的ω-6/ω-3脂肪酸比例均小于大豆油和花生油，在改善我國(guó)居民膳食ω-6/ω-3脂肪酸比例中有著重要作用。因此，可根據(jù)不同作用，采用不同的提取方式對(duì)紅樹莓籽油進(jìn)行提取，具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。