2

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部DUS中心貴陽分中心, 貴陽 550006)

水稻(OryzasativaL.)不僅是重要的糧食作物，也是單子葉植物研究中最重要的模式作物之一。轉(zhuǎn)基因技術(shù)現(xiàn)已成為植物分子生物學(xué)研究基因功能的重要手段[1]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、拷貝數(shù)較低且結(jié)合位點(diǎn)穩(wěn)定等優(yōu)勢，水稻轉(zhuǎn)基因植株絕大部分是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的[2]。以愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體需要對水稻苗幼胚或成熟種子在無菌條件下誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這種方式需要嚴(yán)格的無菌環(huán)境，并且愈傷組織誘導(dǎo)及再分化對基因型依賴性較強(qiáng)，因此,不同水稻品種之間轉(zhuǎn)化難易程度差異較大[3,4,5]。以植物莖尖為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，無需經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)及再分化，具有轉(zhuǎn)化周期短、操作簡單、轉(zhuǎn)基因植物遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn), 已在玉米、棉花、水稻等植物中成功應(yīng)用[6-8]。前期對不同水稻品種的莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化條件研究發(fā)現(xiàn)，不同水稻品種的最適條件各異，且主效因素也不一樣[6,9]。

來攏是從江地區(qū)特有的貴州香禾粳糯品種，前期品質(zhì)測定發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良食味品質(zhì)[10]，可作為水稻品種改良的一種良好材料[11]，但其對稻瘟病抗性較低，需對其進(jìn)行品種改良。本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)也以貴州禾來攏愈傷組織為受體，利用農(nóng)桿菌侵染進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化并已獲得抗除草劑、抗稻瘟病的轉(zhuǎn)基因來攏植株，但轉(zhuǎn)化周期過長，且轉(zhuǎn)化效率較低[12,13]。因此，本研究以貴州禾來攏莖尖為材料設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，研究不同菌液侵染濃度OD600、真空處理時(shí)間、真空滲透壓等因素對貴州禾來攏轉(zhuǎn)化效率及植株死亡率的影響，建立高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)貴州禾來攏遺傳轉(zhuǎn)化體系，為基因工程改良貴州禾來攏奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

植物材料為貴州禾來攏，農(nóng)桿菌菌株為LBA 4404，均由貴州大學(xué)山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。pCambia-Ubi-McCHIT1遺傳轉(zhuǎn)化載體由西南大學(xué)裴炎教授惠贈(zèng)。

1.2 方 法

1.2.1遺傳轉(zhuǎn)化材料的準(zhǔn)備

將貴州禾來攏成熟種子置于10 cm×12 cm網(wǎng)袋中清水浸泡，37 ℃避光培養(yǎng)，每8 h換水1次，待種子露白后，用清水清洗干凈。37 ℃避光催芽生根，待水稻胚芽鞘長至1.5～2.0 cm長時(shí)，切除莖環(huán)上部胚芽，暴露水稻的莖尖分生組織，用于農(nóng)桿菌的侵染及轉(zhuǎn)化。

1.2.2農(nóng)桿菌的活化及培養(yǎng)

取出-80 ℃保存的含有pCambia-Ubi-McCHIT1載體的農(nóng)桿菌LBA 4404，接種到含有50 mg·L-1卡那霉素及20 mg·L-1利福平的YEP固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱中暗培2 d。挑取單菌落于10 mLYEP液體培養(yǎng)基(卡那霉素及利福平濃度分別為50 mg·L-1、20 mg·L-1)中 180 r·min-1，28 ℃振蕩過夜培養(yǎng)。再取100μL菌液繼續(xù)放入新的YEP液體培養(yǎng)基中震蕩過夜，待菌液濃度OD600值達(dá)到0.8左右后，5 000 r·min-1離心收集菌體。

1.2.3遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

選擇農(nóng)桿菌菌液侵染濃度OD600(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2)、真空處理時(shí)間(2、5、8、11、14 min)及真空滲透壓(4、8、12、16、20 kPa)進(jìn)行三因素五水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)為L25(53)正交表(詳見表1)。每個(gè)處理樣本為30粒，并做3次重復(fù)。AAM培養(yǎng)基[14]重懸農(nóng)桿菌菌體并稀釋至相應(yīng)濃度后，加入0.02%表面活性劑Silwet-L 77與100μmol·L-1乙酰丁香酮。將切除胚芽鞘的來攏種子浸泡在重懸后菌液中，使用Bio-Rad臺(tái)式基因槍對其進(jìn)行真空處理，調(diào)節(jié)真空處理時(shí)間與真空處理壓強(qiáng)。處理完畢后，倒掉菌液，用吸水紙吸干后將水稻種子置于濕潤的珍珠巖上，黑暗條件下28 ℃共培養(yǎng)3 d。

表1 遺傳轉(zhuǎn)化正交設(shè)計(jì)與結(jié)果

序號(hào)真空處理時(shí)間/min菌液侵染濃度OD600真空滲透壓/kPa植株死亡率/%GUS基因轉(zhuǎn)化率/%120.441.110.00220.6167.780.00320.883.330.004212011.111.11521.21211.112.22650.488.890.00750.62013.335.56850.81213.336.67951411.114.441051.21618.8910.001180.41213.336.671280.648.896.671380.81613.3313.331481812.228.891581.22024.4417.7816110.41618.8910.0017110.6815.5612.2218110.82028.8921.11191111221.1117.7820111.2428.8912.2221140.42033.3311.1122140.61227.7817.7823140.8435.5616.67241411644.4424.4425141.2847.7817.78

1.2.4植株死亡率及GUS組織化學(xué)檢測統(tǒng)計(jì)

共培3 d后，恢復(fù)正常光照，待水稻幼苗自然生長5 d，統(tǒng)計(jì)水稻幼苗死亡數(shù)；參照J(rèn)efferson[15]的方法，剪取新萌發(fā)的幼苗葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)檢測，統(tǒng)計(jì)GUS染色陽性株數(shù)。計(jì)算植株死亡率和GUS基因轉(zhuǎn)化率。

圖1 pCambia-Ubi-McCHIT1載體結(jié)構(gòu)示意圖

注：A為GUS組織染色(左為貴州禾來攏野生型;右為GUS陽性植株。bar=500 μL)；B為轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(M為Marker;W為貴州禾來攏野生型；P為菌液DNA;3～8為轉(zhuǎn)基因植株)圖2 轉(zhuǎn)基因植株組織化學(xué)染色及PCR檢測

植株死亡率(%)=(植株死亡株數(shù)/總侵染樣本數(shù))×100%；

GUS基因轉(zhuǎn)化率(%)=(GUS染色陽性植株/總侵染樣本數(shù))×100%。

1.2.5轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

將GUS染色陽性植株移栽至土壤中，常規(guī)肥水管理。按天根新型植物DNA提取試劑盒說明書提取來攏野生型及GUS染色陽性水稻葉片DNA，進(jìn)行PCR檢測。PCR的反應(yīng)條件為：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s，54 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。GUS特異性引物：Forward primer：5′-GGTGATTGATGAAACTGCTG-3′；Reverse primer：5′-GAACATTACATTGACGCAGG-3′，產(chǎn)物長度為304 bp。

1.2.6數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件及Microsoft office Excel 2016軟件處理分析，多重比較選用鄧肯氏法。

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對貴州禾來攏死亡率的影響

通過統(tǒng)計(jì)貴州禾來攏死亡株數(shù)，計(jì)算出正交試驗(yàn)中各組植株的死亡率，分析各因素對水稻死亡率的影響。結(jié)果表明，真空處理時(shí)間、菌液侵染濃度OD600、真空滲透壓3個(gè)因素越大，植株死亡率最高(表1)。方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，真空處理時(shí)間與菌液侵染濃度對來攏的死亡率均有顯著影響，真空滲透壓對死亡率影響不大(表2)。極差分析發(fā)現(xiàn)，真空處理時(shí)間的極值(R值)最大達(dá)到30.89，菌液侵染濃度次之，最小的是真空滲透壓。說明真空處理時(shí)間對植株死亡率的影響最大，真空滲透壓影響最小(表3)。

表2 3個(gè)因素對植株死亡率的方差分析

變異來源 平方和自由度均方F真空處理時(shí)間2841.164.00710.2958.16??菌液濃度OD600435.314.00108.838.91??真空滲透壓107.874.0026.972.21誤差146.5612.0012.21

表3 3個(gè)因素對植株死亡率的極差分析

同水平植株死亡率和真空處理時(shí)間菌液侵染濃度OD600真空滲透壓k1j6.8915.1117.11k2j13.1114.6717.56k3j14.4418.8917.33k4j22.6720.0020.67k5j37.7826.2222.22R30.8911.565.11

2.2 各因素對貴州禾來攏遺傳轉(zhuǎn)化率的影響

用于遺傳轉(zhuǎn)化的pCambia-Ubi-McCHIT1載體具有內(nèi)含子GUS報(bào)告基因，轉(zhuǎn)化成功的水稻植株經(jīng)過GUS組織化學(xué)染色會(huì)呈現(xiàn)出藍(lán)色(如圖2 A)。對GUS組織化學(xué)染色陽性植株與來攏野生型的葉片進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以質(zhì)粒DNA為陽性對照，來攏野生型為陰性對照。結(jié)果表明：GUS染色陽性植株與質(zhì)粒DNA均能得到大小304 bp左右的條帶，野生型來攏沒有條帶，說明外源基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入了GUS染色陽性植株(如圖2 B)。

表6 各因素不同水平對植株死亡率及GUS基因轉(zhuǎn)化率的影響

因素水平 真空處理時(shí)間 菌液侵染濃度OD600 真空滲透壓 植株死亡率GUS 基因轉(zhuǎn)化率植株死亡率GUS 基因轉(zhuǎn)化率植株死亡率GUS 基因轉(zhuǎn)化率16.89d0.67e15.11c5.56c17.11b8.00b213.11c5.33d14.67c8.45b17.56b7.78b314.44c10.67c18.89b11.56a17.33b10.22a422.67b14.67b20.00b11.33a20.67a11.55a537.78a17.56a26.22a12.00a22.22a11.33a

注：表中同列不同小寫字母表示p<0.01差異顯著。

對GUS染色檢測呈陽性的植株數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算得出GUS基因轉(zhuǎn)化率，并對其進(jìn)行極差分析與方差分析，結(jié)果表明：真空處理時(shí)間14 min，菌液侵染濃度OD6001.2，真空滲透壓16 kPa植株GUS轉(zhuǎn)化率最高(表1)；方差分析表明，3個(gè)因素均對植株遺傳轉(zhuǎn)化率有顯著影響(表4)；3個(gè)因素的R值大小順序?yàn)檎婵仗幚頃r(shí)間>菌液侵染濃度OD600>真空滲透壓，說明對水稻轉(zhuǎn)化率影響最大的是真空處理時(shí)間，其次為菌液侵染濃度，真空滲透壓對轉(zhuǎn)化率的影響最小(表5)。

表4 3個(gè)因素對GUS基因轉(zhuǎn)化率的方差分析

變異來源平方和自由度均方F真空處理時(shí)間761.2004190.30025.833??菌液濃度OD600122.000430.5004.140?真空滲透壓105.600423.1003.549?誤差88.400127.367

注：“*”表示p<0.05差異顯著，“**”表示p<0.01差異極顯著。

表5 3個(gè)因素對GUS基因轉(zhuǎn)化率的極差分析

同水平GUS基因轉(zhuǎn)化率和真空處理時(shí)間菌液侵染濃度OD600真空滲透壓k1j0.675.568.00k2j5.338.457.78k3j10.6711.5610.22k4j14.6711.3311.55k5j17.5612.0011.33R值16.896.443.78

2.3 各因素的不同水平對植株死亡率及轉(zhuǎn)化效率的綜合影響

隨著真空處理時(shí)間的增長，植株死亡率呈現(xiàn)出增加趨勢。處理5～8 min時(shí)，植株的死亡率并未出現(xiàn)顯著增加；處理時(shí)間大于8 min后，死亡率達(dá)到了20%以上，在14 min時(shí)達(dá)到最大值(為37.78%)。菌液侵染濃度OD600增大，植株死亡率也逐漸增加。當(dāng)菌液濃度OD600達(dá)到1.2時(shí)，植株死亡率最大(為26.22%)。真空滲透壓對植株死亡率影響較小，真空滲透壓低于12 kPa時(shí)，植株死亡率無明顯變化(在17%左右)；高于16 kPa后，死亡率明顯提高(達(dá)到20%以上)。GUS轉(zhuǎn)化率與真空處理時(shí)間成正相關(guān)。真空處理時(shí)間2 min時(shí)，GUS轉(zhuǎn)化率最小(僅達(dá)到0.67%)；在高于8 min后，GUS轉(zhuǎn)化率能達(dá)到10%以上。菌液濃度OD600越大，GUS基因轉(zhuǎn)化率也越大，菌液濃度OD600為1.2時(shí)，GUS基因轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高水平(為12%)。對真空滲透壓與GUS基因轉(zhuǎn)化率結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，滲透壓壓強(qiáng)低于8 kPa時(shí)，GUS基因轉(zhuǎn)化率均處于10%以下；大于12 kPa時(shí)，GUS轉(zhuǎn)化率達(dá)到10%以上，真空滲透壓16 kPa時(shí)基因轉(zhuǎn)化率最大(為11.55%)(表6)。

綜合各因素對植株死亡率及轉(zhuǎn)化效率的影響，認(rèn)為：真空處理11 min，菌液侵染濃度OD6000.8，真空滲透壓16 kPa是農(nóng)桿菌介導(dǎo)貴州禾來攏莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的最優(yōu)參數(shù)。

3 討 論

研究表明，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，外植體類型、菌液濃度、真空滲透壓以及真空處理時(shí)間等因素對植株的轉(zhuǎn)化效率及死亡率有密切的影響[16-18]。菌液濃度作為影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素之一，其最適濃度會(huì)隨著材料及方法的不同而發(fā)生很大的變化[19]。以植物愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體的最適菌液濃度較低，在0.5左右；以莖尖為轉(zhuǎn)化受體的最適菌液濃度偏高，可以達(dá)到0.9以上[20,21]。張笑寒等認(rèn)為，粳型黑糯米“平塘黑糯”與貴州禾“黎平雜邊禾“進(jìn)行莖尖遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建中發(fā)現(xiàn)，菌液濃度與遺傳轉(zhuǎn)化率呈正相關(guān)[9]；黃仁權(quán)等研究表明，菌液濃度對黎平雜邊禾死亡率影響較大但對平塘黑糯的影響不大，推測是由于水稻種類不同導(dǎo)致的[6]。本研究中貴州禾來攏與黎平雜邊禾的結(jié)果類似，菌液濃度對死亡率及轉(zhuǎn)化率均有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究發(fā)現(xiàn)：黑糯具有較白糯更強(qiáng)的抗逆性，可能是由于黑糯含有花青素等抗氧化性較強(qiáng)的物質(zhì)，對生物和非生物脅迫的耐性都強(qiáng)。因此我們推測，黑糯米中由于含有花青素等物質(zhì)，對農(nóng)桿菌濃度的耐受性較高；白糯米對菌液濃度更敏感。

作為輔助農(nóng)桿菌浸染植物的方法，真空滲透處理也會(huì)對植株的遺傳效率產(chǎn)生影響[22]。處理壓強(qiáng)過高、處理時(shí)間過長都會(huì)增大植株死亡率；處理壓強(qiáng)過低及處理時(shí)間過短，則會(huì)讓導(dǎo)入受體的農(nóng)桿菌數(shù)量過少，降低基因的轉(zhuǎn)化率。真空處理時(shí)間是影響貴州禾來攏死亡率及轉(zhuǎn)化率的最關(guān)鍵因素，處理時(shí)間越長，來攏的死亡率與轉(zhuǎn)化率均越高。真空滲透壓壓強(qiáng)對來攏死亡率影響較小，以16 kPa為分界點(diǎn)，滲透壓壓強(qiáng)大于16 kPa后植株死亡率顯著提高到20%以上。來攏轉(zhuǎn)化率則以真空滲透壓12 kPa為分界點(diǎn)，高于12 kPa轉(zhuǎn)化率明顯升高。說明貴州禾來攏對真空處理具有一定適應(yīng)力，短時(shí)間的高滲透壓對來攏的影響并不大，但長時(shí)間的處理會(huì)對來攏造成十分嚴(yán)重的影響。