趙 星,李云建,韓 偉,張夢(mèng)瑤,劉斯婕,李玉榮

(1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院,河北石家莊 050035; 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所,河北石家莊 050035)

花生,又名落花生,是我國(guó)主要的油料作物,2016年我國(guó)花生年產(chǎn)量已達(dá)1728.98萬(wàn)噸,居世界首位[1]。目前,我國(guó)花生的開(kāi)發(fā)利用仍以花生仁榨油為主,約占花生果重量三分之一的花生殼,僅有少量被加工成飼料和制成化工原料,利用率低,造成極大的資源浪費(fèi)。花生殼中除含有粗纖維、粗蛋白、粗脂肪、糖類(lèi)以及礦物質(zhì)等成分外,還含有多種黃酮類(lèi)成分,如木犀草素、香葉木素、5,7,3′,4′-tetrahydroxy-8-prenyflavone、圣草酚、5-羥基-色原酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、5,7,3′-trihydroxy-4′-methoxy-8-prenylflavone、大風(fēng)子素、racemoflavone、5,7-二羥基色原酮等,以木犀草素含量最高[2-4]。研究表明,從花生殼中提取黃酮類(lèi)化合物并生產(chǎn)的“脈舒膠囊”,具有良好的降血壓、降血脂作用[1,5],而花生的品種、產(chǎn)地等因素均會(huì)影響花生殼中總黃酮的含量[6-7],因此,建立并優(yōu)化出適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法對(duì)花生殼中總黃酮的開(kāi)發(fā)利用與質(zhì)量控制尤為重要。

總黃酮的含量測(cè)定一般采用分光光度法,包括直接測(cè)定法和可見(jiàn)區(qū)絡(luò)合法,直接測(cè)定法由于被測(cè)溶液的基底易產(chǎn)生干擾,所以可見(jiàn)區(qū)絡(luò)合法應(yīng)用較多,如鹽酸-鎂粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法等[8-9]。目前,花生殼中總黃酮的測(cè)定多采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法[10],然而,測(cè)定過(guò)程中尚存在樣品與對(duì)照溶液絡(luò)合后的光譜圖差別較大等問(wèn)題[11],由于中藥成分復(fù)雜,測(cè)定總部位時(shí)干擾成分多,為了保證測(cè)定的專(zhuān)屬性、靈敏度與準(zhǔn)確度,以對(duì)照品與供試品共有吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行含量測(cè)定為佳,選擇適宜的對(duì)照品與適宜的絡(luò)合方法顯得尤為重要。然而,不同絡(luò)合方法測(cè)定花生殼中總黃酮含量的適應(yīng)性研究卻未有相關(guān)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)選用蘆丁和木犀草素兩種常見(jiàn)對(duì)照品為參考,從方法適應(yīng)性、方法重復(fù)性、供試品溶液穩(wěn)定性方面比較測(cè)定總黃酮含量的三種常用絡(luò)合方法,選出測(cè)定花生殼中總黃酮含量的最佳方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,為花生殼的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生 購(gòu)自河北省滄州市;木犀草素(純度≥98%) 上海金穗生物科技有限公司;蘆丁(純度≥98%) 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;無(wú)水乙醇 分析純,天津市百世化工有限公司;亞硝酸鈉 分析純,天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠(chǎng);硝酸鋁 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉 分析純,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;無(wú)水氯化鋁 分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸 分析純,天津市歐博凱化工有限公司;濃鹽酸 分析純,武漢市鑫華松化工有限公司;鎂粉 分析純,北京求賢化工廠(chǎng);蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制。

WH-71型電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;BJ-800A中藥粉碎機(jī) 德清拜杰電器有限公司;FA2004B型電子天平 上海天美天平儀器有限公司;SB-5200DTD型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;LDZ4-12型低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;TGL-16G型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);TU-1950雙光束可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;NewClassic MF分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市順華儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別取蘆丁、木犀草素對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,置于25 mL量瓶中,以75%乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得濃度分別為339、299 μg/mL的儲(chǔ)備液,于4 ℃冷藏保存,備用,臨用前以75%乙醇稀釋至所需濃度。

1.2.2 樣品溶液的制備 將花生殼洗凈,干燥,粉碎,過(guò)60目篩,干燥至恒重。取花生殼粉末適量,精密稱(chēng)定,置于50 mL EP管中,精密加入75%(v/v)乙醇30 mL,潤(rùn)濕,室溫下浸泡2 h,超聲波輔助提取(50 Hz,200 W)30 min后,離心(4000 r/min)10 min,分離上清液再次離心(12000 r/min)20 min,取上清液,即得樣品溶液。

1.2.3 鹽酸-鎂粉法 取花生殼粉末1 g,精密稱(chēng)定,其余按照1.2.2制備樣品溶液。參考文獻(xiàn)[12]方法,精密量取此樣品溶液、113 μg/mL蘆丁對(duì)照品溶液、299 μg/mL木犀草素對(duì)照品溶液各500 μL,分別置于有300 mg鎂粉的具塞刻度試管中,將試管置于冷水浴(15 ℃)中,緩緩滴加3 mL濃鹽酸,并不時(shí)振搖試管。待反應(yīng)充分后加入75%乙醇至7 mL,置于沸水浴中加熱60 min,取出,迅速冷卻至室溫,用75%乙醇補(bǔ)足至7 mL,搖勻,于350～700 nm下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。精密量取75%乙醇500 μL,按上述過(guò)程操作,作為空白對(duì)照,即得樣品溶液、蘆丁對(duì)照品溶液、木犀草素對(duì)照品溶液鹽酸-鎂粉法全波長(zhǎng)掃描圖。以水代替濃鹽酸,同法操作,即得未經(jīng)絡(luò)合樣品溶液全波長(zhǎng)掃描圖。

1.2.4 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法 取花生殼粉末1.5 g,精密稱(chēng)定,其余按照“1.2.2 樣品溶液的制備”項(xiàng)下操作制備樣品溶液。參考文獻(xiàn)[13-14]方法,精密量取此樣品溶液、339 μg/mL蘆丁對(duì)照品溶液、299 μg/mL木犀草素對(duì)照品溶液各500 μL,分別置于5 mL棕色量瓶中,加入5% NaNO2溶液150 μL,搖勻,靜置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液150 μL,搖勻,靜置6 min后,加入4% NaOH溶液2 mL,用水稀釋至刻度,搖勻,轉(zhuǎn)移至離心管中,室溫離心(12000 r/min)3 min后,分離上清液,于350～700 nm下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。精密量取75%乙醇500 μL,按上述過(guò)程操作,作為空白對(duì)照,即得樣品溶液、蘆丁對(duì)照品溶液、木犀草素對(duì)照品溶液NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法全波長(zhǎng)掃描圖。以水代替Al(NO3)3溶液,同法操作,即得未經(jīng)絡(luò)合樣品溶液全波長(zhǎng)掃描圖。

1.2.5 AlCl3法 取花生殼粉末1 g,精密稱(chēng)定,其余按照“1.2.2 樣品溶液的制備”項(xiàng)下操作制備樣品溶液。參考文獻(xiàn)[8]方法,精密量取此樣品溶液、170 μg/mL蘆丁對(duì)照品溶液、74.8 μg/mL木犀草素對(duì)照品溶液各500 μL,分別置于5 mL棕色量瓶中,加入0.1 mol/L AlCl3溶液250 μL,醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH5.5)500 μL,用75%乙醇稀釋至刻度,搖勻,靜置15 min,于350～700 nm下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。精密量取75%乙醇500 μL,同法操作,作為空白對(duì)照,即得樣品溶液、蘆丁對(duì)照品溶液、木犀草素對(duì)照品溶液AlCl3法全波長(zhǎng)掃描圖。以水代替AlCl3溶液,按上述過(guò)程操作,即得未經(jīng)絡(luò)合樣品溶液全波長(zhǎng)掃描圖。

1.2.6 方法學(xué)驗(yàn)證 按照《中國(guó)藥典》2015版《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求進(jìn)行操作[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸-鎂粉法適應(yīng)性考察

采用鹽酸-鎂粉法獲得的蘆丁對(duì)照品溶液、木犀草素對(duì)照品溶液、樣品溶液、未經(jīng)絡(luò)合樣品溶液全波長(zhǎng)掃描圖,如圖1所示。由圖1可知,采用鹽酸-鎂粉法制備的供試品溶液的全波長(zhǎng)掃描圖在370～550 nm之間存在兩個(gè)吸收峰,其中最大吸收波長(zhǎng)為423 nm,而未經(jīng)絡(luò)合樣品溶液的全波長(zhǎng)掃描圖在此區(qū)間未出現(xiàn)吸收峰,二者的區(qū)別說(shuō)明花生殼提取物中黃酮類(lèi)成分在該試驗(yàn)條件下已發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。蘆丁對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)為390 nm,與供試品的匹配性差。木犀草素對(duì)照品在400～550 nm之間存在兩個(gè)吸收峰,且最大吸收波長(zhǎng)為422 nm,與供試品相匹配,其圖譜在350～395 nm之間吸光度出現(xiàn)負(fù)值,推測(cè)是由于溶液中較大濃度的木犀草素(299 μg/mL)消耗了反應(yīng)體系中大量的鎂離子,而鎂離子在此波段具有吸收而形成。由此可見(jiàn),鹽酸-鎂粉法可用于測(cè)定花生殼中總黃酮的含量,應(yīng)選擇木犀草素為對(duì)照品,測(cè)定波長(zhǎng)423 nm,此時(shí),樣品中其他成分對(duì)測(cè)定的干擾小。

圖1 鹽酸-鎂粉法全波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 Full wavelength scanning of Mg-HCl method

2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法適應(yīng)性考察

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法獲得的蘆丁對(duì)照品溶液、木犀草素對(duì)照品溶液、樣品溶液、未經(jīng)絡(luò)合樣品溶液全波長(zhǎng)掃描圖如圖2所示。由圖2可知,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法制備的供試品溶液全波長(zhǎng)掃描圖在400～650 nm之間存在吸收峰,且其在440～520 nm范圍內(nèi)吸光度曲線(xiàn)平緩,吸收峰不明顯,而未經(jīng)絡(luò)合樣品溶液的全波長(zhǎng)掃描圖在400～650 nm之間呈現(xiàn)下降趨勢(shì),二者的差異說(shuō)明花生殼提取物中黃酮類(lèi)成分在該試驗(yàn)條件下已發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),且在吸收峰處,絡(luò)合前后吸光度差值小(ΔA<0.270)。為了盡可能排除樣品中非黃酮類(lèi)成分對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾,使方法具有更好的專(zhuān)屬性,應(yīng)選擇供試品與未經(jīng)絡(luò)合樣品溶液吸光度差值最大處作為測(cè)定波長(zhǎng),即519 nm(ΔAmax=0.269)。蘆丁與木犀草素對(duì)照品在450～650 nm之間存在吸收峰,其最大吸收波長(zhǎng)分別為514與510 nm。由此可見(jiàn),NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法可用于測(cè)定花生殼中總黃酮的含量,測(cè)定波長(zhǎng)519 nm時(shí),樣品中其他成分對(duì)測(cè)定干擾較小,木犀草素與蘆丁均可作為對(duì)照品,且木犀草素較蘆丁更適合。

圖2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法全波長(zhǎng)掃描圖Fig.2 Full wavelength scanning of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH method

2.3 AlCl3法適應(yīng)性考察

采用AlCl3法獲得的蘆丁對(duì)照品溶液、木犀草素對(duì)照品溶液、樣品溶液、未經(jīng)絡(luò)合樣品溶液全波長(zhǎng)掃描圖如圖3所示。由圖3可知,采用AlCl3法制備的供試品溶液全波長(zhǎng)掃描圖在380～500 nm之間存在吸收峰,其最大吸收波長(zhǎng)為402 nm,未經(jīng)絡(luò)合樣品溶液的全波長(zhǎng)掃描圖在350～500 nm之間吸光度明顯下降,二者的差異說(shuō)明花生殼提取物中黃酮類(lèi)成分在該試驗(yàn)條件下已發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。蘆丁對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)為417 nm,木犀草素對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)為408 nm,故AlCl3法可用于測(cè)定花生殼中總黃酮的含量,應(yīng)選擇木犀草素為對(duì)照品,測(cè)定波長(zhǎng)402 nm,此時(shí),樣品中其他成分對(duì)測(cè)定干擾較小。

圖3 AlCl3法全波長(zhǎng)掃描圖Fig.3 Full wavelength scanning of AlCl3 method

2.4 三種絡(luò)合方法重復(fù)性的比較

取同一花生殼粉末,分別采用鹽酸-鎂粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法項(xiàng)下操作,測(cè)定波長(zhǎng)分別為423、519、402 nm,平行6份,計(jì)算吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,%)。由同一分析人員使用同一臺(tái)分光光度計(jì)進(jìn)行方法的重復(fù)性比較,結(jié)果如表1所示。

表1 三種絡(luò)合方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Investigation on repeatability of three complexing methods

經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn),采用三種方法測(cè)定花生殼提取物中總黃酮的含量,方法重復(fù)性以AlCl3法最佳(RSD<1%),其余依次為NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、鹽酸-鎂粉法。研究發(fā)現(xiàn),鹽酸-鎂粉法操作過(guò)程較繁瑣,極易引入偶然誤差,因此方法重復(fù)性最差,且耗時(shí)長(zhǎng),反應(yīng)過(guò)程需濃鹽酸,亦存在一定危險(xiǎn)性;NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法操作相對(duì)簡(jiǎn)便,方法重復(fù)性較鹽酸-鎂粉法好,但反應(yīng)后的供試品溶液易產(chǎn)生渾濁,需經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾或高速離心后才能準(zhǔn)確測(cè)定,操作較繁瑣;AlCl3法操作簡(jiǎn)便,且方法重復(fù)性好,能夠滿(mǎn)足分析方法的測(cè)定要求[12]。由此可見(jiàn),AlCl3法在測(cè)定花生殼中總黃酮含量時(shí)的方法重復(fù)性明顯優(yōu)于鹽酸-鎂粉法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法。

2.5 三種絡(luò)合方法穩(wěn)定性的比較

將采用鹽酸-鎂粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法項(xiàng)下制備的供試品溶液,于室溫下放置0、5、10、20、40、60 min后測(cè)定吸光度,測(cè)定波長(zhǎng)分別為423、519、402 nm,以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)作圖,結(jié)果如圖4所示。

圖4 三種絡(luò)合方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Investigation on stability of three complexing methods

由圖4可知,采用鹽酸-鎂粉法制備的供試品溶液在室溫放置20 min內(nèi)吸光度波動(dòng)較大(RSD=7.85%),20 min后,吸光度雖略有降低,但曲線(xiàn)平穩(wěn),可有效減少乃至消除因供試品放置時(shí)間或測(cè)定順序的不同而產(chǎn)生的測(cè)定誤差(RSD=0.49%),故建議在采用鹽酸-鎂粉法測(cè)定花生殼中總黃酮含量時(shí),供試品溶液于室溫下靜置20 min后測(cè)定。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法制備的供試品溶液的吸光度在0～60 min內(nèi)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),穩(wěn)定性差(RSD=9.69%),因此測(cè)定過(guò)程中,需嚴(yán)格控制供試品溶液的放置時(shí)間,才能有效減少乃至消除由此產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。采用AlCl3法制備的供試品溶液的吸光度在0～60 min內(nèi)幾乎無(wú)變化(RSD=0.43%),穩(wěn)定性好。由此可見(jiàn),AlCl3法在測(cè)定花生殼中總黃酮含量時(shí)供試品溶液的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于鹽酸-鎂粉法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法,不易因放置時(shí)間或測(cè)定順序的不同而引入誤差,有利于大批量樣品的同時(shí)測(cè)定。

2.6 三種絡(luò)合方法的評(píng)價(jià)

蘆丁是自然界中廣泛存在的黃酮類(lèi)成分,NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法即源自于蘆丁的含量測(cè)定,后來(lái)被逐步應(yīng)用于黃酮類(lèi)化合物的測(cè)定[8],因此,可采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法,將總黃酮的含量以蘆丁為對(duì)照品計(jì),測(cè)定與比較不同中藥總黃酮的含量。木犀草素為花生殼中含量豐富的黃酮類(lèi)活性成分[3,16],研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論采用何種絡(luò)合方法,同蘆丁相比,木犀草素絡(luò)合后的吸收峰均與花生殼中總黃酮更為接近,因此,采用絡(luò)合方法測(cè)定花生殼中總黃酮的含量,可首選木犀草素作為對(duì)照品。

鹽酸-鎂粉法在15 ℃水浴中,利用黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇在鹽酸-鎂粉作用下被還原,生成橙紅到紅紫色物質(zhì)。整個(gè)過(guò)程需控制濃鹽酸的加入速度并不時(shí)振搖刻度試管,以控制鹽酸和鎂粉反應(yīng)的劇烈程度與顯色劑和樣品的接觸程度[17],過(guò)程較為嚴(yán)苛,且因使用濃鹽酸而具備一定的危險(xiǎn)性,不適用于大批量樣品的同時(shí)測(cè)定,且本研究發(fā)現(xiàn),在三種絡(luò)合方法的比較中,該方法測(cè)定花生殼中總黃酮含量的重復(fù)性相對(duì)較差,不宜作為首選方法。

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法和AlCl3法的原理均是利用黃酮類(lèi)化合物與Al3+形成的絡(luò)合物。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法并非黃酮類(lèi)化合物的專(zhuān)屬反應(yīng),凡具有鄰苯二羥基的物質(zhì),均能用此法進(jìn)行絡(luò)合顯色[18]。AlCl3法則是在酸性條件下,Al3+只與酮羰基及其臨位的羥基發(fā)生絡(luò)合,生成黃色絡(luò)合物,其反應(yīng)過(guò)程如圖5所示[8],可有效減少乃至消除具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的非黃酮類(lèi)化合物的干擾,專(zhuān)屬性更強(qiáng)。同時(shí),本研究發(fā)現(xiàn),在所選條件下,測(cè)定花生殼提取液中總黃酮的含量,料液比1∶15 g/mL制備的花生殼樣品溶液經(jīng)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法顯色后,吸光度在0.4左右,而料液比1∶30 g/mL制備的花生殼樣品溶液與74.8 μg/mL木犀草素對(duì)照品溶液經(jīng)AlCl3法顯色后,吸光度已達(dá)0.5左右,由此可見(jiàn),AlCl3法的靈敏度更高,在朗伯-比爾定律的最佳區(qū)域內(nèi)易獲得更寬的線(xiàn)性范圍;另一方面,NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法供試品溶液的穩(wěn)定性差,在測(cè)定過(guò)程中,需嚴(yán)格控制放置時(shí)間,才能有效減少乃至消除由此產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差,不適用于大批量樣品的同時(shí)測(cè)定。

綜合比較三種絡(luò)合方法后發(fā)現(xiàn),以木犀草素為對(duì)照品,測(cè)定波長(zhǎng)為402 nm時(shí),AlCl3法的靈敏度高、專(zhuān)屬性好、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高,且操作簡(jiǎn)便快速,成本低廉,適用于大批量樣品的同時(shí)測(cè)定,可作為花生殼中總黃酮含量測(cè)定的首選方法。

2.7 AlCl3法的方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍 精密量取濃度分別為19.9、39.9、59.8、79.7、100.0 μg/mL的木犀草素對(duì)照品溶液500 μL,按照“1.2.5 AlCl3法”項(xiàng)下操作,于402 nm下測(cè)定吸光度。以木犀草素對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),如圖6所示,線(xiàn)性方程為y=0.0078x-0.0099(r=0.9997),表明該方法在木犀草素濃度為19.9～100 μg/mL濃度范圍內(nèi),與吸光度成良好線(xiàn)性關(guān)系。

圖6 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.6 Luteolin standard curve

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液,于402 nm下測(cè)定吸光度,連續(xù)6次,計(jì)算吸光度的RSD=0.16%,表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品溶液,按照“1.2.5 AlCl3法”項(xiàng)下操作,于402 nm下測(cè)定吸光度,平行6次,計(jì)算吸光度的RSD=0.96%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下所用的樣品溶液250 μL,精密加入濃度為99.7 μg/mL的木犀草素對(duì)照品溶液170 μL和75%乙醇80 μL,其余按照“1.2.5 AlCl3法”項(xiàng)下操作,于402 nm下測(cè)定吸光度,平行6次,結(jié)果如表2所示?；厥章试?7%～103%范圍內(nèi),RSD=2.36%,表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 AlCl3法回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Investigation on recovery of AlCl3 method

2.7.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,室溫放置0、5、10、20、40、60 min后,于402 nm下測(cè)定吸光度,結(jié)果如表3所示,供試品溶液在0～60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD=0.43%)。

表3 AlCl3法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Investigation on stability of AlCl3 method

3 結(jié)論

采用光譜分析技術(shù),比較了鹽酸-鎂粉法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法對(duì)花生殼中總黃酮含量的測(cè)定效果,發(fā)現(xiàn)同蘆丁相比,更宜采用木犀草素為對(duì)照品。鹽酸-鎂粉法測(cè)定花生殼中總黃酮含量時(shí),操作繁瑣苛刻,耗時(shí)長(zhǎng),重復(fù)性差;NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法供試品溶液穩(wěn)定性差,且其他成分易干擾測(cè)定結(jié)果,靈敏度也較低。因此,測(cè)定花生殼中總黃酮含量的首選方法為AlCl3法,經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,測(cè)定波長(zhǎng)402 nm時(shí),木犀草素在19.9～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度成良好的線(xiàn)性關(guān)系,該方法專(zhuān)屬性好,靈敏度高,準(zhǔn)確度高,重復(fù)性好,穩(wěn)定性高,且操作簡(jiǎn)便快速,成本低,適用于大批量花生殼樣品中總黃酮含量的測(cè)定。本文可為花生殼中黃酮類(lèi)成分的深入研究及其在功能食品和藥品方面的質(zhì)量控制提供參考。